红色荧光蛋白和荧光素酶双报告基因转基因小鼠的建立

背景与目的:活体动物体内光学成像(optical in vivo imaging)主要采用生物发光与荧光两种技术。生物发光是用荧光素酶(luciferase,Luc)基因标记细胞或DNA,而荧光技术则采用荧光报告基团(GFP、RFP、Cyt及dyes等)进行标记,利用一套非常灵敏的光学检测仪器,能够直接监控活体生物体内的细胞活动和基因行为,生物发光成像具有高的灵敏度和特异性,同时生物发光信号可用于精确定量,而荧光成像具有方便、便宜、直观、标记靶点多样和易于被大多数研究人员接受的优点。本研究基于慢病毒介导的转基因方法制备红色荧光蛋白(red fluorescent protein,RFP)和Luc双报告基因转基因小鼠(即RL转基因小鼠),将这两种技术融为一体。方法:制备携带RFP和Luc基因(简写RL基因)的慢病毒,然后将携带RL基因的慢病毒注入小鼠单细胞受精卵卵周隙以感染受精卵,胚胎移植进假孕母鼠以获得仔鼠,应用小动物活体成像仪、体视荧光显微镜和PCR等在蛋白和DNA水平上筛选和鉴定,并获得RL转基因小鼠。结果:移植卵周隙注射有慢病毒的胚胎125枚给6只假孕母鼠,其中4只假孕母鼠怀孕,共生仔鼠20只;利用小动物活体成像仪检测RFP和Luc表达,在蛋白水平证实20只F0代中,3只高表达RFP和Luc;DNA水平检测证实,3只RFP和Luc阳性的小鼠基因组中确实整合有外源转基因RL,预示基因型鉴定结果很好验证了小动物活体成像仪筛选和鉴定结果。此外,RL转基因首建鼠基因组中整合的RL转基因可稳定遗传至下一代,并能正常表达。RL转基因小鼠主要脏器均可见红色荧光和Luc信号,但不同脏器间荧光和Luc强度有差异。结论:成功制备RL双报告基因转基因小鼠,为后续研究干细胞在肿瘤发生、发展和转移中的作用和造血重构等提供双报告基因标记的各种移植用供体细胞,并对此供体细胞及其在体内衍生的细胞进行灵敏的非损伤、实时可视化体内跟踪。     

miR-20a通过靶向抑制PTEN诱导肝癌细胞放射抵抗

目的 探讨miR-20a在肝癌放射敏感性中的作用及机制。方法 荧光定量PCR检测肝癌细胞系和组织标本中miR-20a的表达;构建稳定过表达miR-20a肝癌细胞系,通过克隆实验探讨miR-20a对肝癌细胞放射敏感性影响;蛋白印记法检测Bcl-2、Caspase-3以及γ-H2AX的表达;生物信息学预测miR-20a下游调控的靶基因,双荧光素酶报告系统、荧光定量PCR及蛋白印记法进一步验证;在稳定过表达miR-20a的肝癌细胞系中转染pCDNA3.0-PTEN探讨细胞放射敏感性的变化,明确PTEN是否为miR-20a诱导肝癌放射抵抗的一个功能性靶基因。结果 miR-20a在肝癌细胞系和组织标本中表达上调(P<0.05);经过同等条件的放射处理后,与空白及对照组(WT组、LV-con组)相比,过表达miR-20a组(LV-miR-20a组)细胞存活分数升高,放射抵抗增强(P<0.05),Bcl-2表达上调,Caspase-3及γ-H2AX表达下调;过表达PTEN能够逆转miR-20a引起的放射抵抗。结论 miR-20a在肝癌细胞系及组织标本中表达上调;过表达miR-20a可以促进肝癌细胞放射抵抗,PTEN是miR-20a诱导肝癌放射抵抗的一个功能性靶基因,预示着miR-20a/PTEN位点可能是是肝癌临床放疗相关的有效分子靶点。     

慢病毒载体法制备荧光素酶转基因小鼠

目的基于慢病毒介导的转基因方法制备荧光素酶(Luc)转基因小鼠。方法制备携带Luc基因的慢病毒,将其注入小鼠单细胞受精卵卵周隙以感染受精卵,然后将胚胎移植进假孕母鼠体内以获得仔鼠,应用小动物活体成像仪及PCR等在蛋白和DNA水平上筛选和鉴定Luc转基因小鼠。结果移植慢病毒隙感染后的成活胚胎63枚。将其移植至3只假孕母鼠,其中2只怀孕,共生仔鼠11只;利用小动物活体成像仪检测Luc表达,在蛋白水平证实11只F0代中,3只(命名为S1、S2、S3)表达Luc;DNA水平检测证实,3只Luc阳性小鼠的基因组中整合有外源转基因Luc。此外,Luc转基因首建鼠基因组中整合的Luc转基因可稳定遗传至下一代,并能正常表达。Luc转基因小鼠主要脏器如睾丸、肾脏、胃、肠、肺、脑、胸腺、肝脏和心脏等均可见Luc信号,但不同脏器间Luc强度有差异。结论成功制备Luc报告基因转基因小鼠。     

人参皂甙Rg1对Cdk5的调控在海马神经元放射性损伤防护中的意义

目的 探讨人参皂甙Rg1对Cdk5的调控在海马神经元放射性损伤防护中的意义.方法 通过建立放射性脑损伤的体内模型,将40只实验大鼠按随机数字表法分为4组,每组10只,即：0Gy组（简称空白组）,单纯人参皂甙Rg1预处理组（简称对照组）,30Gy组（简称模型组）,30Gy＋人参皂甙Rg1预处理组（简称中药组）,分离、培养海马神经元,用4＇,6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）染核方法检测各组海马神经元凋亡情况,采用Western blot检测p35、p25蛋白表达以及应用Cdk5抑制剂roscovitine抑制Cdk5,观察阻断Cdk5后X射线对各组海马神经元损伤的改变.结果 与空白组比较,对照组的核固缩百分数、神经元存活数目、p35、p25蛋白表达水平差异无统计学意义（P＞0.05）,模型组与中药组的核固缩百分数、p35、p25蛋白水平则明显升高,神经元存活数目明显降低,且差异有统计学意义（P＜0.05）;与模型组比较,中药组的核固缩百分数、p35、p25蛋白水平明显降低,神经元存活数目则明显升高,差异有统计学意义（P＜0.05）;单就各组＋二甲基亚砜（DMSO）而言,与空白组＋ DMSO比较,对照组＋DMSO的核固缩百分数差异无统计学意义（P＞0.05）,模型组＋DMSO与中药组＋DMSO则明显升高,差异有统计学意义（P＜0.05）;与模型组＋ DMSO比较,中药组＋DMSO的核固缩百分数明显降低,差异有统计学意义（P＜0.05）.结论 人参皂甙Rg1可通过调控Cdk5,降低神经元凋亡,而在海马神经元放射性损伤中发挥防护作用.     

建立慢病毒介导的miR-145稳定过表达的鼻咽癌细胞株

目的 构建过表达miR-145的慢病毒载体,建立稳定过表达miR-145的鼻咽癌细胞株.方法 构建慢病毒表达质粒pLVTHM/miR-145;293FT细胞进行慢病毒包装,生产的慢病毒感染鼻咽癌细胞株CNE1和CNE2,经流式细胞仪筛选后,建立稳定表达miR-145的鼻咽癌细胞株;最后应用荧光定量PCR检测病毒感染后鼻咽癌细胞株CNE1和CNE2中miR-145的表达水平.结果 荧光定量PCR结果和测序验证pLVTHM/miR-145重组质粒构建成功;包装生产的慢病毒感染鼻咽癌细胞CNE1和CNE2后,与阴性对照组比较,其表达水平分别升高4000倍和4500倍.结论 成功构建了pLVTHM/miR-145慢病毒重组质粒,建立稳定表达miR-145的鼻咽癌细胞株CNE1和CNE2,为研究miR-145在鼻咽癌发生发展过程中的基因调控和相应的作用机制提供了有用的细胞模型.     

慢病毒载体法制备荧光素酶转基因小鼠

目的基于慢病毒介导的转基因方法制备荧光素酶（Luc）转基因小鼠。方法制备携带Luc基因的慢病毒,将其注入小鼠单细胞受精卵卵周隙以感染受精卵,然后将胚胎移植进假孕母鼠体内以获得仔鼠,应用小动物活体成像仪及PCR等在蛋白和DNA水平上筛选和鉴定Luc转基因小鼠。结果移植慢病毒隙感染后的成活胚胎63枚。将其移植至3只假孕母鼠,其中2只怀孕,共生仔鼠11只;利用小动物活体成像仪检测Luc表达,在蛋白水平证实11只F0代中,3只（命名为S1、S2、S3）表达Luc;DNA水平检测证实,3只Luc阳性小鼠的基因组中整合有外源转基因Luc。此外,Luc转基因首建鼠基因组中整合的Luc转基因可稳定遗传至下一代,并能正常表达。Luc转基因小鼠主要脏器如睾丸、肾脏、胃、肠、肺、脑、胸腺、肝脏和心脏等均可见Luc信号,但不同脏器间Luc强度有差异。结论成功制备Luc报告基因转基因小鼠。     

MiR-124通过靶向PRRX1调节结直肠癌细胞的辐射敏感性

目的检测结直肠癌细胞及组织标本中miR-124的表达,探讨其与辐射敏感性的关系。方法qRT-PCR检测结直肠癌细胞 株和组织标本中miR-124的表达,建立过表达和干扰miR-124细胞株,功能实验探讨其对结直肠癌细胞辐射敏感性的影响;生 物信息学预测miR-124下游调控的靶基因,双荧光素酶报告系统进一步验证。结果miR-124在结直肠癌细胞株和组织标本中 表达下调;过表达miR-124 增强结直肠细胞辐射敏感性,反之,抑制miR-124 后细胞辐射敏感性降低;miR-124 通过直接抑制 PRRX1调节结直肠细胞辐射敏感性。结论miR-124可以通过直接靶向PRRX1增加结直肠癌细胞的辐射敏感性,为提高临床 结肠癌辐射敏感性提供一个靶点。     

miR-106b靶向调控PTEN促进结直肠癌细胞放射抵抗

目的 阐明miR-106b在结直肠癌细胞放射敏感性中的作用及机制。方法 构建稳定过表达和干扰miR-106b结直肠癌细胞系,通过免疫荧光和平板克隆实验探讨miR-106b对结直肠癌细胞放射敏感性的影响;Western blot检测Caspase-3和γ-H2AX的表达;生物信息学预测miR-106b下游调控的靶基因,双荧光素酶报告系统、荧光定量PCR及Western blot进一步验证。在稳定过表达miR-106b的结直肠癌细胞系中转染pCDNA3.0-PTEN,探讨细胞放射敏感性变化,明确miR-106b是否通过靶向调控PTEN增加结直肠癌细胞放射抵抗。结果 在结直肠癌细胞系过表达miR-106b,经过同等条件的照射处理后,与对照组相比,过表达miR-106b组细胞存活分数升高,放射抵抗增强(P<0.05),Caspase-3及γ-H2AX表达降低。在稳定过表达miR-106b的细胞中上调PTEN后能逆转miR-106b引起的放射抵抗。结论 miR-106b通过靶向抑制PTEN从而诱导结直肠癌细胞放射抵抗,预示着miR-106b-PTEN位点可能为临床提高结直肠癌放疗效果寻找相关靶点提供理论依据。     

携带Fluc和ZsGreen双报告基因小鼠iPS细胞系的建立

背景与目的:诱导性多潜能干细胞(induced pluripotent stem cells,iPS细胞)在修复受损组织器官和治疗人类疾病方面已展示了良好的应用前景,但iPS细胞具有形成畸胎瘤的作用,这是其安全应用于临床的巨大障碍之一。为此本研究拟利用慢病毒体外感染的方法,建立携带萤火虫荧光素酶(firefly luciferase,Fluc)和绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,ZsGreen)双报告基因的小鼠iPS细胞系,为活体动态监测畸胎瘤形成、定植和形成畸胎瘤所需最小细胞剂量等提供实验基础。方法:构建含Fluc和ZsGreen双报告基因的慢病毒载体。以pLH2BmRFP质粒为模板,PCR扩增获得Fluc基因片段,将其克隆至利用BamHⅠ酶切的pHAGE-fullEF1a-MCS-IZsGreen质粒中,挑选一个阳性克隆质粒进行测序,最终获得携带双报告基因的慢病毒载体pEF1a-Fluc-IRES-ZsGreen(pELZG)。采用脂质体介导的瞬时转染生产携带Fluc和ZsGreen基因的病毒,收集病毒上清,并感染iPS细胞,数天后荧光显微镜下观察是否有绿色荧光的iPS细胞克隆,不断挑取ZsGreen阳性的iPS细胞克隆以进一步纯化。将标记好的iPS细胞移植入裸鼠皮下,观察成瘤情况。结果:pELZG载体分别经XbaⅠ、PvuⅡ、SacⅠ单酶切,得到的片段大小分别为10.005、3.282和6.723 kb,2.441、3.401和6.604 kb,预示成功构建了Fluc和ZsGreen双报告基因的慢病毒载体。利用其生产的病毒上清成功感染iPS细胞,经过不断的纯化,最终获得含稳定表达Fluc和ZsGreen双报告基因的小鼠iPS细胞系。将标记好的iPS细胞植入裸鼠皮下后,观察到畸胎瘤的形成。结论:成功建立了携带Fluc和ZsGreen双报告基因的小鼠iPS细胞系,为相关后续研究打下了良好的基础。标记后的iPS细胞对畸胎瘤的形成和发展具有很好的示踪作用。