双色红外荧光在蛋白检测中的优势

目的：通过比较Western blot的两种不同显色方法,了解双色红外荧光检测技术在蛋白检测中的优势。方法：制备L-02肝细胞总蛋白,SDS-PAGE电泳分离后转膜,内参蛋白GADPH,β-actin一抗孵育,二抗用藕联有IRDye700、IRDye800的荧光抗体和辣根过氧化物酶抗体,通过双色红外荧光检测技术和化学发光法检测,比较相同量时,两种方法的灵敏度及特异性差异。结果：双色法显色的图像较化学发光法更清晰直观,且实验背景低。结论：双色红外荧光检测提高了蛋白检测灵敏度,保证实验结果的准确,在蛋白检测方面具有不可比拟的优势。     

SET-EGFP重组表达质粒的构建及表达

目的构建癌蛋白SET与增强型绿色荧光表达载体（EGFP）的融合表达质粒pEGFP—N2-SET并获得表达。方法根据人SET基因序列。设计了一对含有Kozak序列、终止密码子、HindⅢ和KpnI酶切位点的引物。从人L-02肝细胞提取总RNA，以逆转录后cDNA为模板，PCR扩增获得SET基因片段，经双酶切后回收得到有以上两个酶切位点的SET基因片段，将此基因片段克隆至相同酶切回收后的pEGFP—N2载体中，获得重组质粒pEGFP—N2-SET。以Lipofectamine^TM2000为载体，将构建好的真核表达质粒转染到L-02肝细胞中进行瞬时表达。结果。经DNA测序鉴定证实，pEGFP—N2-SET重组质粒构建成功，经荧光倒置显微镜观察，证实能在细胞内进行蛋白表达。结论SET表达质粒的成功构建及表达为其进一步结构和功能研究奠定了基础。     

人SET基因RNA干扰重组质粒载体的构建及其在肝细胞中的表达

目的建立真核质粒载体介导的人SET基因RNA干扰表达体系,并检测其在肝细胞中对SET蛋白表达的影响,为研究SET蛋白在三氯乙烯致肝细胞毒性的作用打下基础。方法设计并合成2对人SET基因特异性短发夹RNA（short hair-pin RNA,shRNA）寡核苷酸链,退火形成双链DNA后插入到真核表达质粒psiRNA-hH1 neo中产生shRNA重组质粒载体,经酶切和测序鉴定成功后,转染至L-02肝细胞中,48h后收集细胞提取总蛋白,Western blotting检测干扰后SET蛋白的表达。结果 shRNA重组质粒的酶切和测序鉴定均正确,Western blotting结果显示重组质粒psiRNA1组的干扰效果较好,对SET蛋白表达的抑制率达60%左右,与正常对照组相比,差异具有统计学意义（P〈0.05）。结论成功构建针对人SET基因的RNA干扰真核质粒载体,其能有效地抑制肝细胞内SET蛋白的表达,为深入研究SET蛋白在三氯乙烯致肝细胞毒性中的作用奠定了基础。     

人SET基因RNA干扰重组质粒载体的构建及其在肝细胞中的表达

目的建立真核质粒载体介导的人SET基因RNA干扰表达体系,并检测其在肝细胞中对SET蛋白表达的影响,为研究SET蛋白在三氯乙烯致肝细胞毒性的作用打下基础。方法设计并合成2对人SET基因特异性短发夹RNA(short hair-pin RNA,shRNA)寡核苷酸链,退火形成双链DNA后插入到真核表达质粒psiRNA-hH1 neo中产生shRNA重组质粒载体,经酶切和测序鉴定成功后,转染至L-02肝细胞中,48h后收集细胞提取总蛋白,Western blotting检测干扰后SET蛋白的表达。结果 shRNA重组质粒的酶切和测序鉴定均正确,Western blotting结果显示重组质粒psiRNA1组的干扰效果较好,对SET蛋白表达的抑制率达60%左右,与正常对照组相比,差异具有统计学意义(P<0.05)。结论成功构建针对人SET基因的RNA干扰真核质粒载体,其能有效地抑制肝细胞内SET蛋白的表达,为深入研究SET蛋白在三氯乙烯致肝细胞毒性中的作用奠定了基础。     

高剂量三氯乙烯对L-02肝细胞中Rho GDIα表达的影响

背景与目的:观察高剂量三氯乙烯(trichlomethylene,TCE)对L4Y2肝细胞中Rho GDIα基因在mRNA及蛋白水平表达的影响.材料与方法:以β-actin为内参,采用蛋白印迹(western blot)和实时荧光定量RT-PCR技术对分别40 μmol/L TCE(实验组)和DMSO(溶剂对照组)处理的正常L-02肝细胞中的Rim GDIα蛋白和mRNA水平进行检测.结果:高剂量TCE处理后Rho GDIα mRNA表达量显著下降而蛋白含量明显升高.结论:Rho GDIα基因表达在高剂量TCE处理后发生了特异性改变,为揭示TCE对机体的损伤作用机制提供了重要线索.     

三氯乙烯对L-02肝细胞Rho GDIα、ANXA3及GLO1表达的影响

目的 研究三氯乙烯(trichloroethylene,TCE)处理L-02肝细胞后,Rho鸟苷二磷酸分离抑制因子(Rho GDI α)、膜联蛋白A3(ANXA3)及乙二醛酶Ⅰ(GLO1)的表达变化.方法 以40 μmol/LTCE对L-02肝细胞进行染毒处理,DMSO做溶剂对照.分别采用蛋白质印迹(Western blot)法和实时荧光定量反转录一聚合酶链反应(real-time quantitative RT-PCR)法检测Rho GDIα、ANXA3及GLO1在蛋白质和mRNA水平的表达变化.结果 Western blot法分析结果 显示,TCE处理后Rho GDI α、ANXA3和GLO1蛋白表达水平均上调,差异有统计学意义(P<0.05);实时荧光定量RT-PCR结果 显示,TCE处理后ANXA3和GLO1 mRNA表达的相对值分别为2.786±0.492和1.893±0.402,而Rho GDIα的mRNA表达的相对值为0.563±0.106,与对照组比较,差异有统计学意义(P<0.05).结论 TCE刺激后,RhoGDI α、ANXA3和GLO1蛋白分别在蛋白质和转录水平发生了相应变化,为进一步研究和揭示TCE致肝细胞损伤的分子机制奠定了基础.     

低剂量三氯乙烯诱导下谷胱甘肽转移酶Ω-1的表达变化

目的分析低剂量三氯乙烯(TCE)诱导的细胞兴奋效应时,谷胱甘肽转移酶Ω-1(GSTO-1)的表达变化。方法利用前期的双向电泳和质谱结果,参照前期兴奋效应的剂量设计,提取染毒细胞的mRNA和总蛋白,进一步使用实时定量RT-PCR和Western blotting分别从mRNA和蛋白水平上验证GSTO-1的表达变化。结果 Western blotting分析发现,0.1mmol/LTCE剂量组能诱导GSTO-1蛋白表达是对照组的2倍,但随着剂量的增加,蛋白表达改变不明显(与对照组相比,P<0.05)。RT-PCR结果提示:低剂量TCE能诱导GSTO-1基因表达增加,随着剂量的增加,表达反而有所减少。结论低剂量TCE能诱导GSTO-1基因及蛋白表达增加。