人GRP94基因慢病毒载体构建及稳定表达GRP94蛋白的人宫颈癌HeLa细胞株筛选及鉴定

目的:构建人葡萄糖调节蛋白 94(GRP94)基因慢病毒载体,筛选稳定表达GRP94蛋白的人宫颈癌细胞株,筛选GRP94结合蛋白,为探讨GRP94对宫颈癌的调控作用提供细胞模型。方法:采用RT-PCR法从HeLa细胞中扩增GRP94基因片段,连接到慢病毒载体pLVX-IRES-Hyg中,获得重组载体。瞬时转染293T细胞,采用Western blotting 法检测GRP94蛋白表达量。pLVX-FLAG-GRP94重组质粒通过与包装质粒共转染293T细胞,获得重组慢病毒。以慢病毒感染HeLa细胞,筛选并鉴定稳定表达GRP94蛋白的细胞株。用稳定表达FLAG-GRP94的HeLa细胞株,银染后利用质谱筛选结合蛋白,并经免疫共沉淀验证。结果:重组慢病毒载体经双酶切和基因测序比对鉴定正确。HeLa细胞经慢病毒感染,药物筛选后获得的稳定表达株中GRP94蛋白表达量高于野生型HeLa细胞(P<0.01)。成功钓取出一种与肿瘤发生发展密切相关的SND1蛋白。结论:成功构建了GRP94基因慢病毒载体pLVX-FLAG-GRP94,并筛选出稳定表达GRP94蛋白的HeLa细胞株,为进一步明确肿瘤的发生、发展机制奠定了基础。     

溶出伏安法测定血清中维生素K3

目的:建立一种快速、准确、灵敏的测定血清中维生素K(3VK3)的电化学方法。方法:镀汞膜修饰玻碳电极为工作电极,Ag/AgCl电极为参比电极,铂片电极为辅助电极,组成三电极体系,在pH=9.4、浓度为1.0 mol.L-1氨水-氯化铵缓冲液的底液中,用差分脉冲溶出伏安法对血清中VK3进行测定。结果:峰电流(ip)与VK3的浓度(C)在0.23～1.6 ng.mL-1范围内呈现良好的线性关系,检出限为0.23 ng.mL-1,并具有很好的平行性,对于0.92 ng.mL-1的VK3,6次平行测定结果的标准偏差RSD为1.64%。应用此方法对血清中VK3含量进行了测定,方法的平均回收率为99.91%,RSD为1.03%。结论:该方法与高效液相色谱法相比简单、快速、灵敏度高,可作为血清中VK3的高敏检测方法。