肿瘤转移相关基因 TMSG-1编码蛋白的定位

目的　明确肿瘤转移相关基因TMSG 1编码蛋白在细胞内的定位。方法　计算机分析TMSG 1的跨膜区 ,构建GFP与TMSG 1融合蛋白表达载体pEGFP C1 TMSG 1,以LipofectAMINE介导转染人前列腺癌细胞PC 3M 1E8,荧光显微镜与共聚焦显微镜下观察。结果　计算机分析表明所示 ,TMSG 1有四个跨膜区 (aa33～ 4 8,aa6 4～ 79,aa114～ 130 ,aa15 8～ 174 ) ,推测其为跨膜蛋白。PSORTⅡ软件分析TMSG 1蛋白定位于胞浆 (可靠性 94 .1% ) ,具体位置为内质网 6 6 .7%、线粒体 11.1%、质膜 11.1%、高尔基体 11.1%。显微镜下观察TMSG 1 GFP融合蛋白表达于胞浆 ,呈不均匀的颗粒状、环状分布 ;而对照的GFP蛋白则在胞核和胞浆呈弥漫性分布。结论　TMSG 1蛋白定位于细胞内膜系统 ;利用GFP进行的亚细胞定位具有精确、快速、可重复等优点 ,是研究基因与蛋白定位的有效方法。     

TIMP－1基因转染对人肺巨细胞癌细胞系生物学行为的影响

利用基因重组技术构建了一个含有全长人ＴＩＭＰ－１ｃＤＮＡ的真核表达重组体。重组质粒通过脂质体法导入高转移入肺巨细胞癌细胞系（ＰＧ细胞）。随机挑选５个Ｇ４１８抗性克隆，并对其中的两个克隆ＰＧ－Ｔ２和ＰＧＴ４进行了深入的研究。Ｎｏｒｔｈｅｒｎ印迹表明，这两个克隆具有较高的ＴＩＭＰ－１ＲＮＡ表达，其表达水平明显高于ＰＧ细胞和空载体转染对照细胞ＰＧ－ＭＶ。ＰＧ－Ｔ２和ＰＧ－Ｔ４克隆细胞显示出很高的ＴＩＭＰ－１蛋白活性，相同条件下ＰＧ和ＰＧ－ＭＶ未能显示出具有ＴＩＭＰ－１蛋白活性。此外，与其母系ＰＧ细胞及空载体转染对照细胞ＰＧ－ＭＶ相比，ＴＩＭＰ－１转染细胞的增殖速度和侵袭能力明显下降，其在软琼脂上形成克隆和在裸鼠体内成瘤的能力丧失。提示ＰＧ细胞中ＴＩＭＰ－１基因的特异性上调不仅能抑制其侵袭能力，而且对其增殖和成瘤产生抑制作用。     

3种中药有效成分对幽门螺杆菌培养滤液转化的人胃黏膜上皮细胞的杀伤作用

目的明确3种中药有效成分三七皂甙、黄芪皂甙及黄芩甙单用或配伍对经过幽门螺杆菌培养滤液转化后的永生化人胃黏膜上皮GES-1细胞(简称HP细胞)的凋亡诱导作用。方法以三七皂甙、黄芪皂甙及黄芩甙单独或联合作用HP细胞,AnnexinV及PI双染,流式细胞仪检测药物对HP细胞凋亡/坏死的影响;电镜和Hoechst33258及PI双染荧光显微镜观察凋亡细胞形态。结果三七皂甙、黄芪皂甙及黄芩甙单用可引起HP细胞凋亡及死亡比例增加并呈一定的时间依赖性,配伍应用作用强于单独应用(与对照组比较P<0.05),增强程度从大至小依次为三药合用>三七皂甙黄芪皂甙合用>黄芪皂甙黄芩甙合用>三七皂甙黄芩甙合用。结论3种中药有效成分单用及配伍对HP细胞有明显的毒性作用;引起细胞死亡的机制部分是通过诱导凋亡实现的;不同药物配伍应用的增效程度不同。     

肿瘤转移抑制基因1抑制前列腺癌细胞的增殖和侵袭能力

目的 研究肿瘤转移抑制基因1(TMSG-1)转染对高转移人前列腺癌细胞体外增殖能力和侵袭能力的影响.方法 将TMSG-1全长真核表达载体稳定转染人前列腺癌细胞高转移亚系PC-3M-1E8,G418筛选,逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)和Western blot方法选取TMSG-1过表达阳性克隆.通过活细胞计数、二苯基溴化四氮唑蓝(MTF)比色实验、软琼脂集落形成实验检测体外细胞生长能力;Matrigel穿膜实验检测肿瘤细胞体外侵袭能力.结果 在稳定转染TMSG-1基因的PC-3M-1E8细胞系中,筛选出3株TMSG-1转录活性及蛋白表达水平均明显升高的细胞用于后续生物学行为实验.活细胞计数和MTT比色实验结果显示,从计数第3天起,与空载体对照组和空白对照组相比,3株正义转染组细胞生长速度均明显减慢(P<0.05).软琼脂集落形成实验结果显示,3株正义转染组的细胞软琼脂集落形成数与空载体对照组、空白对照组相比,均明显减少(P<0.05),分别为26.00±3.21、13.33±1.45和32.83±2.18.Matrigel穿膜实验结果显示,正义转染的各组细胞与空载体对照组及空白对照组相比,穿膜细胞数均明显减少(P<0.05),分别为45.33±4.16、54.00±2.83和26.33±3.79.结论 TMSG-1表达上调可使高转移人前列腺癌细胞体外增殖速度、锚着不依赖性生长能力及侵袭能力明显降低,TMSG-1可能通过抑制肿瘤细胞生长和侵袭抑制肿瘤转移潜能.     

鞘糖脂微结构域1相关磷酸化蛋白基因的筛选及其对转移性前列腺癌细胞生物学行为的影响

目的 筛选肿瘤转移相关新基因,探讨鞘精脂微结构域1相关磷酸化蛋白基因(PAG1)转染对人前列腺癌细胞系PC-3M的高转移亚系PC-3M-1E8体外生物学行为的影响.方法 利用PC-3M高转移亚系PC-3M-1E8、低转移亚系PC-3M-284,人肺巨细胞痛细胞系(PG)高转移亚系PG-BE1和低转移亚系PG-LH7 cDNA制作4张基因芯片,筛选出PC-3M和PG高、低转移亚系共同差异表达基因.对在两个转移亚系共同表达下调的PAG1基因做进一步研究,采用即时定量PCR及Western blot验证PAG1在PC-3M细胞系中的表达.构建pcDNA3.0-PAG1真核表达载体,稳定转染PC-3M-1E8细胞.MTT比色实验及软琼脂集落形成实验检测肿瘤细胞体外增殖能力;流式细胞术检测肿瘤细胞周期及凋亡;Matrigel穿膜实验检测肿瘤细胞体外侵袭能力.结果 基因芯片初步筛选出PC-3M高、低转移亚系差异表达基因共327个,上调基因123个,下调基因204个.PG高、低转移亚系差异表达基因共281个,上调基因167个,下调基因114个.PC-3M与PG高转移亚系共同表达下调基因9个、上调基因8个.即时定量PCR及Western blot证实PAG1在PC-3M高转移亚系中表达低于低转移亚系.MTT比色及软琼脂集落形成实验显示转染pcDNA3.0-PAG1组细胞增殖速度明显低于转染空载体组和未转染组(均P<0.05).细胞周期检测转染pcDNA3.0-PAG1组比转染空载体组和未转染组处于G_0～G_1期的细胞百分数明显增加(P<0.05).转染pcDNA3.0-PAG1组与转染空载体组和未转染组相比凋亡细胞百分率无显著差异(P>0.05).体外穿膜侵袭实验结果表明转染pcDNA3.0-PAG1组比转染空载体组和未转染组穿膜细胞数目明显减少,分别为(35.1±4.9)、(127.6±6.6)和(135.0±5.0)个(P<0.05).结论 利用同一母系来源的高、低转移亚系制作基因芯片可以摒除转移无关基因的干扰,筛选出差异表达的肿瘤转移相关基因.PAG1基因稳定转染能抑制人前列腺癌高转移亚系PC-3M-1E8细胞的体外增殖能力和侵袭能力,PAG1基因可能是一个潜在的肿瘤增殖、侵袭和转移的抑制基因.     

Identification of metastasis associated gene G3BP by differential display in human cancer cell sublines with different metastatic potentials G3BP as highly expressed in non-metastatic

Objective　To investigate genes involved in cancer metastasis, mRNA differential display was used to compare the levels of gene expression in two cell sublines derived from human giant cell carcinoma of lung (PG) which had different metastatic potentials. Methods　Using in vivo tumorigenicity and a spontaneous metastasis assay in nude mice, two sublines (BE1, LH7) from human giant cell carcinoma of lung (PG) with different metastatic potentials were isolated and characterized. mRNA differential display was used to compare the levels of gene expression between them and the obtained results were confirmed by Northern hybridization. Results　One differentially expressed band was nearly identical (99% homology) to Ras-GTPase-Activating protein SH3 domain binding protein (G3BP). G3BP displayed a strong expression in LH7 (non-metastatic in recipient nude mice) and a very weak expression in BE1 (100% metastatic frequency). The same different expression level of G3BP was detected in Northern hybridization with another panel of cell sublines with different metastatic potentials (established in our lab) derived from human prostate carcinoma cell line PC-3M. Conclusion　Our results indicate that G3BP was implicated in cancer metastasis because of its differential expressions in the two panels of cell sublines with different metastatic potentials.     

应用差异显示技术从高低转移癌系克隆出肿瘤转移相关基因G3BP

目的　克隆肿瘤转移相关基因。方法　应用倍比稀释法对人肺巨细胞癌PG进行单细胞克隆 ,并应用裸鼠异种接种及自发性转移体内实验对各亚系的转移潜能进行鉴定。以具有不同转移潜能的癌细胞亚系为研究对象 ,应用mRNA差异显示技术克隆差异片段 ,sanger双脱氧末端终止法测序及自动双向测序获得其碱基序列 ,与GenBank数据库进行同源性比较。在两组具有不同转移潜能的癌细胞亚系 (人肺癌 ,前列腺癌 )中Northern杂交验证表达差异。结果　两个具有不同转移潜能的亚系BE1和LH7,在完全相同的遗传背景下 ,亚系BE1在裸鼠体内 10 0 %成瘤 ,10 0 %转移 ;亚系LH7在裸鼠体内 10 0 %成瘤 ,无一例转移。二者转移表型的显著差异必然反映了转移相关基因表达与调控的差异。因此该系统是mRNA差异显示的良好模型。应用mRNA差异显示技术克隆差异片段 ,一个84 9bp片段在高转移亚系BE1中低表达 ,而在不转移亚系LH7高表达 ,二者差异显著 ,在重复实验中得到了验证。成功的回收该片段 ,连接入pGEM T载体 ,经sanger双脱氧末端终止法测序及自动双向测序获得其碱基序列 ,经GenBankBlastn检索 ,与G3BP(U32 519)同源性高达 99%。Northern杂交显示G3BP在LH7高表达 (约 3 3kb) ,而在BE1中低表达 ,验证了差异显示的结果 ,排除了假阳性的可能性     

三种中药有效成分对转化的人胃黏膜上皮细胞的抑制作用

目的:明确三种中药有效成分三七皂甙(PNS)、黄芪皂甙(AS)及黄芩甙(Ba)单用或配伍对永生化的人胃黏膜上皮细胞GES-1以及经过幽门螺杆菌(HP)培养滤液转化后的GES-1细胞(HP细胞)增殖能力的影响.方法:以HP培养上清滤液作用GES-1细胞,通过描绘细胞生长曲线、软琼脂集落形成试验和裸鼠成瘤试验检测细胞恶性转化程度.分别以不同浓度的三七皂甙、黄芪皂甙及黄芩甙处理两种细胞,四甲基谷氮唑盐(MTT)法及软琼脂集落形成试验检测三种药物单用及配伍对细胞增殖活性的影响.结果:HP滤液作用后的GES-1细胞增殖活性升高,软琼脂集落形成能力增强,但仍不能在裸鼠体内成瘤.PNS、AS及Ba对GES-1和HP细胞的增殖活性有明显的抑制作用,并有随剂量增加作用增强的趋势.三药配伍应用对两种细胞的抑制作用增强,还能明显抑制HP细胞的软琼脂集落形成能力.结论:HP滤液能促进GES-1细胞的进一步转化.三种药物有效成分显著抑制GES-1及HP细胞的增殖,三药配伍抑制作用有不同程度的增强.