弓形虫免疫作图蛋白1(TgIMP1)表位疫苗的设计及构建北大核心CSCD

目的设计基于弓形虫免疫作图蛋白1(TgIMP1)抗原蛋白的表位疫苗并进行结构验证。方法分别采用IEDB和ABCpred软件预测TgIMP1蛋白的B细胞抗原表位,分别采用SYFPEITHI和IEDB软件预测TgIMP1蛋白的T细胞抗原表位,运用DNA man比对筛选出T-B联合表位,在PfIMP2同源结构中验证表位性质并设计TgIMP1优势表位盒。结果通过计算机虚拟设计,得到了4条TgIMP1的优势B细胞表位(B1-B4)和2条优势T细胞表位(T1-T2),6条优势表位均处于PfIMP2结构外侧的无规卷曲区,且均为极性表面,适合作为表位疫苗的备选肽段。结论根据预测结果构建了3种TgIMP1优势表位盒,为多价表位疫苗的研发奠定基础。     

腺病毒siRNA抑制RhoA基因并联合TNF-α诱导肝癌细胞凋亡的研究

目的建立RhoA基因的腺病毒siRNA系统,并联合TNF-α诱导肝癌细胞凋亡,分析RhoA在肿瘤细胞中的功能和作用。方法用已构建的RhoA干扰质粒构建RhoA的腺病毒siRNA系统,筛选重组病毒并感染HepG2细胞,应用Western blot和RT-PCR检测RhoA蛋白表达和基因表达水平。感染Ad-siRNA-RhoA腺病毒的肝癌细胞用TNF-α诱导后进行MTT以及细胞内DNA片段化检测。结果成功构建RhoA基因的siRNA腺病毒系统。用重组病毒感染肝癌细胞,RhoA蛋白表达抑制率为76.48%;RhoA基因的mRNA转录水平降低74.46%。MTT检测显示,感染腺病毒Ad-U6-control对照组以及感染腺病毒Ad-siRNA-RhoA实验组的细胞A值差异无统计学意义(F=5.41,P>0.01),即利用siRNA抑制肝癌细胞中RhoA表达,肿瘤细胞凋亡不明显。TUNEL检测显示,RhoA腺病毒siRNA联合TNF-α致肿瘤细胞凋亡作用显著。结论构建的腺病毒siRNA载体系统能抑制目的基因RhoA的表达,联合TNF-α能抑制肿瘤细胞生长和增殖并诱导肿瘤细胞凋亡,为肿瘤基因功能的基础研究和肿瘤基因治疗打下了实验基础。     

山东省2例输入性卵形疟病例报告

本文报告了2例国外输入卵形疟病例。两患者均为非洲几内亚务工返乡人员,回国后数月因发热、乏力而就医。入院血膜镜检见多期卵形疟疟原虫,环状体较粗大,大滋养体期、配子体期颗粒较粗;受染红细胞明显变形,呈多种不规则形状,具备卵形疟原虫特点。PCR基因产物约800bp,与卵形疟相符。对两患者应用蒿甲醚肌注和伯氨喹口服规范治疗,分别于7d、10d痊愈出院。     

3种方法提取血膜疟原虫DNA的比较研究

目的对3种提取血膜疟原虫DNA的方法进行比较研究,筛选出从血膜中提取疟原虫DNA的最佳方法。方法血膜依次经过二甲苯脱油和乙醇脱色处理,然后分别采用Na2HPO4法、Chelex-100法和试剂盒法提取DNA。根据疟原虫小亚基核糖体RNA编码基因(18SSSU rRNA)保守区设计套式PCR引物,分别以3种方法提取的疟原虫DNA为模板进行套式PCR扩增,并对扩增产物进行测序分析。结果疟原虫新血膜(保存1年内)3种方法提取的DNA经PCR扩增后均呈阳性且测序成功,与镜检结果一致。Chelex-100法提取的旧血膜(保存1~5年)标本和试剂盒法提取的旧血膜和陈旧血膜(保存6~10年)的DNA经PCR扩增后均呈阳性且测序成功,与镜检结果一致。结论 3种方法均可成功提取新血膜疟原虫DNA,Chelex-100法可提取旧血膜的疟原虫DNA,试剂盒提取法适用于旧血膜和陈旧血膜的疟原虫DNA的提取。     

海藻酸钠-成年软骨细胞培养移植修复成年兔关节软骨缺损的研究

目的 利用海藻酸纳-成年软骨细胞复合构建工程化软骨,并观察应用该工程软骨移植修复成年兔关节软骨缺损的长期效果。方法 取34周龄成年新西兰兔双膝关节软骨,分离软骨细胞.与海藻酸钠混合,细胞密度为4×10~6/ml,通过硅胶模型制成圆形柱状海藻酸纳-软骨细胞盘(20μl/个),体外培养。分别于2、4、6、8、10周取细胞盘,行苏木素-伊红(HE)、AB-PAS染色、免疫组织化学分析。同时选用成年新西兰兔28只,两侧股骨内髁造成全层软骨缺损模型,缺损处随机植入体外培养4周的海藻酸钠一软骨细胞盘(实验组)及无细胞的海藻酸钠载体(对照组),分别于术后6、12、24、48周取材,观察软骨缺损修复情况。结果 成年软骨细胞在海藻酸钠中呈丛状或球状增殖,4周时达增殖高峰,培养期内软骨细胞始终呈圆形或椭圆形,免疫组织化学显示盘中Ⅱ型胶原含量丰富,无Ⅰ型胶原产生。动物实验实验组软骨缺损以透明样软骨修复为主,对照组则以纤维组织填充为主,48周时两组修复组织均有一定程度退变。结论 成年软骨细胞在海藻酸钠中体外培养可维持良好的细胞表型,并形成工程化软骨。用此工程化软骨修复关节软骨损伤经48周观察有透明样软骨修复。     

弓形虫表面抗原SAG2基因的克隆表达纯化及鉴定

目的构建弓形虫表面抗原2(SAG2)基因重组质粒并在大肠埃希菌中表达。方法根据SAG2基因序列设计并合成引物,用PCR法从弓形虫基因组DNA中扩增SAG2基因片段,再克隆到p GEX-4T载体中,构建重组质粒。重组质粒经酶切鉴定并测序后,在大肠埃希菌BL21中诱导表达,产物经SDS-PAGE分析并纯化,以Western blotting分析其反应原性。结果 SAG2基因PCR产物大小约为561 bp,与预期相符。重组质粒经酶切及PCR鉴定构建成功,测序结果与已知序列吻合。重组质粒转化菌经IPTG诱导后表达的SAG2融合蛋白分子量约为47 ku,该蛋白可被GST标签抗体识别。结论成功重组了弓形虫SAG2基因,表达蛋白具有反应原性。     

诱导型siRNA技术及其应用研究进展

RNA干扰为基因和蛋白质学的研究等提供了崭新的技术方法,诱导型siRNA主要是通过构建诱导型siRNA表达载体,实现siRNA技术对目的基因的可调控表达,为基因功能的研究、疾病基因治疗、疾病模型的建立、药物筛选等提供更完善的研究方法。本文主要对诱导型siRNA近年来的发展和应用进行综述。     

弓形虫微线蛋白16抗原表位区的预测及酵母表面展示

目的应用生物信息学软件预测弓形虫微线蛋白16(TgMIC16)B/T细胞抗原表位并对抗原表位区进行酿酒酵母菌的表面展示。方法利用DNAStar和IEDB对TgMIC16进行B细胞抗原表位预测,利用SYFPEITHI和BIMAS预测其T细胞抗原表位。参照预测结果,采用pCTCON2/EBY100展示系统对抗原表位区进行酵母表面展示,利用间接免疫荧光(IFA)和流式细胞仪检测表达情况。结果 TgMIC16存在潜在的B/T细胞抗原表位且集中在aa343-625区域;该抗原表位区成功展示到酵母细胞表面,最佳诱导时间为24~36h。结论为下一步酵母载体疫苗的研制及疗效评价奠定基础。     

猫肠上皮细胞的原代培养及cDNA文库的构建

目的建立猫肠上皮细胞(Intestinal epithelial cells,IECs)培养体系,构建其酵母双杂交cDNA文库,为筛选弓形虫毒性因子在终末宿主的互作蛋白奠定基础。方法分别采用组织块法以及低浓度胶原蛋白酶Ⅺ和中性蛋白酶Ⅰ联合消化法进行猫IECs的原代培养,通过形态学观察及细胞免疫组织化学方法鉴定后提取mRNA,运用SMART技术合成cDNA第一链,以LD-PCR扩增获得双链cDNA(ds cDNA),通过同源重组方法在酵母菌株Y187中构建猫IECs的cDNA文库,计算文库的容量,以酵母菌液PCR检测插入片段的大小分布。结果两种培养方法效果表明酶联合消化法更为有效。本研究建立了连续培养猫IECs体系,培养出高纯度的猫IECs,用其构建的cDNA文库容量为1.1×10~6,滴度为2.8×10~9cfu/ml,插入片段大小在0.5~2.0 kb之间。结论培养的原代猫IECs构建的cDNA文库符合酵母双杂交筛选互作因子标准,这为筛选弓形虫终末宿主的毒性因子互作蛋白奠定了基础。     

山东省间日疟原虫MSP-1和CSP等位基因型及同源性分析

目的分析山东省间日疟原虫MSP-1和CSP基因类型及其同源性,为病例溯源提供科学依据。方法采集2011年山东省报告的12例间日疟患者血样,提取疟原虫基因组DNA;分别根据间日疟原虫MSP-1和CSP基因序列设计引物,进行巢式PCR扩增、酶切、测序、序列比对及同源性分析。结果 12份间日疟患者血样MSP-1基因全部出现470bp扩增条带以及350、120 bp酶切片段,均为Sal-1型;MSP-1进化树分析显示,9份省内感染者样品序列同属一个分枝,1份印度感染者样品序列与印度分离株位于同一分枝。12份间日疟患者样品CSP基因均包含GDRA(D/A)GQPA序列,为PV-Ⅰ型,其中10份省内感染者和1份广东感染者样品CSP基因出现560~840 bp和150~230 bp两种扩增条带,为PV-Ⅰ型温带族,1份在印度感染者样品CSP基因仅出现560~840 bp条带,为PV-Ⅰ型热带族。CSP进化树表明,10份省内感染者及1份广东感染者样品序列同属一个分枝,1份在印度感染者样品序列与印度和印度尼西亚分离株位于同一分枝。结论山东省本地感染间日疟原虫MSP-1基因型均为Sal-1型,CSP基因型均为PV-Ⅰ型温带族,本地虫株具有较强的基因同源性。