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应用同源重组技术构建小鼠Cchl1a3基因R528H突变型打靶载体的策略 总被引:1,自引:0,他引:1
目的构建小鼠Cchl1a3基因R528H突变型基因敲入打靶载体,模仿低血钾周期性麻痹患者中的对应发现。方法采用置换型载体,分为长短、短臂设计(1.5~2.0kb),以便用聚合酶链反应(PCR)方法筛选中靶载体和ES细胞(embrgonic stem cell)。首先以Cchl1a3基因为模板设计引物,并引入与质粒内插入位点酶切序列相配的内切酶序列,扩增用于套取的同源臂a和b,以及用于插入筛选基因和实行定点突变的同源臂c和d,c和d首尾相接,用点突变特异性PCR在c内实现R528H突变。将a和b定向插入pBR322,借助于温度敏感的pSC101-BAD-gba-(tet)质粒的表达Red/ET重组酶,使其与携带Cchl1a3基因的细菌人工染色体(BAC)实现同源重组,套取含目的突变点、长约8kb的Cchl1a3的基因片断,形成pBR322-Cchl1a3。将c和d定向插入PL451质粒Frt-Neo-Frt片段两侧,酶切c-Frt-Neo-Frt-d片断纯化后,再与pBR322-Cchl1a3质粒一同转入含Red/ET重组酶基因的大肠杆菌EL250菌株,在重组酶的催化下再次实现同源重组,在Cchl1a3基因的给定位点实现R528H突变并插入包含筛选基因和重组酶识别位点的Frt-Neo-Frt片断,完成载体的构建。载体构建过程中,酶切位点变化导致的片断程度改变作为初筛,PCR产物测序结果作为最后的鉴定依据。结果打靶载体符合设计要求。结论运用点突变特异性PCR,结合Red/ET重组技术构建基因定点突变的基因敲入型打靶载体,在重组酶催化下仅需要2次同源重组即可完成。该策略成熟简便,省时省力,构建的载体易于鉴定。 相似文献
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甲亢性低血钾型周期性麻痹家系基因突变的初步研究 总被引:2,自引:0,他引:2
目的筛查甲亢性低血钾型周期性麻痹家系的钙离子通道α1亚基和电压门控钠离子通道α亚基基因是否存在突变。方法总结甲亢性低血钾型周期性家系Ⅵ代患者的临床特点,并应用酶联免疫测定和测序技术筛查编码钙离子通道α1亚基的528位及1239位精氨酸和钠离子通道α亚基669位及672位精氨酸基因的突变点。结果钠离子通道α亚基基因2012位碱基序列发生错义突变(T→C),671位苯丙氨酸变为丝氨酸,而其他3个已知突变点的碱基序列完全正常。结论华人甲亢性低血钾型周期性麻痹家系患者中存在突变,致使钠离子通道α亚基基因671位苯丙氨酸为丝氨酸替代,该位点国内外未见报道,是一个新的突变位点。 相似文献
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目的筛查低血钾性周期性麻痹家系的骨骼肌二氢吡啶受体敏感的钙离子通道α1亚基和骨骼肌电压门控钠离子通道α亚基基因突变.方法总结低血钾型周期性麻痹家系Ⅵ代27例患者的临床特点,并应用聚合酶链反应和高液相变性技术筛查编码钙离子通道α1亚基的528位及1239位精氨酸和钠离子通道α亚基669位及672位精氨酸基因的突变点.结果钙离子通道α1亚基编码528位精氨酸的1582位碱基序列发生错义突变(C→G),编码的精氨酸变为甘氨酸,528位精氨酸被甘氨酸替代,而其他3个已知突变点的碱基序列完全正常.结论国人钙离子通道α1亚基存在528位精氨酸被甘氨酸替代突变,与国外报道的钙离子通道α1亚基528位精氨酸被组氨酸、1239精氨酸被组氨酸、1239精氨酸被甘氨酸和钠离子通道α亚基基因的669精氨酸被组氨酸替代,或672位的精氨酸被组氨酸、甘氨酸、色氨酸、半胱氨酸替代的突变不同,是一个新的突变类型. 相似文献
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国产新型医院船在未来海上卫勤保障中合理使用的探讨 总被引:1,自引:0,他引:1
目的 探讨新型医院船列装后的合理使用.方法 分析医院船性能及装备,结合近期满负荷演练的情况,并参考文献报道的海上卫勤演练成果加以探讨.结果 国产新型医院船具备现代化大型医院船的要求和特点,仍有某些问题,如伤病员无障碍运送、网络系统及重要设备的稳定运行等有待于完善.演练时需予以指挥组足够的授权,此外,周密的计划,相对同定... 相似文献
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现代化大型医院船医疗卫勤力量建设研究 总被引:5,自引:1,他引:4
新列装的医院船具备现代化大型医院船的要求和特点,仍有细节部分,如伤病员无障碍运送,网络系统及重要设备的稳定运行,有待于完善。为更好地发挥医院船的卫勤支援作用,除应借鉴以往的卫勤演练经验,仍需在实践中对人员、装备反复演练,医院船与性能各异的水面舰艇编队训练亦应重视。演练中指挥组的授权,周密的计划,相对固定的医疗队人员构成,客观、令面的总结至关重要。通过演练可获得战时医院船医护人员编组及医用耗材配备等重要数据。换乘依旧是海上卫勤演练的难点与重点。通过互访和交流借鉴外军的经验也十分重要。 相似文献
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