Jagged1过表达促进老龄大鼠来源的内皮祖细胞向成熟内皮细胞分化

 目的：探讨上调Jagged1表达对内皮培养条件下老龄大鼠来源的内皮祖细胞（EPC）向内皮细胞分化的影响。方法：脱臼处死1～2月龄和19～26月龄SD大鼠,PBS冲洗股骨和胫骨骨髓,Ficoll密度梯度离心分离单个核细胞, 应用含10% FBS的DMEM/F12培养基以差速贴壁法进行体外培养,DiI-ac-LDL与FITC-UEA-1荧光双染进行EPC特性鉴定。实验分为4组：对照组、PIRES2-EGFP转染组、PIRES2-EGFP-Jagged1转染组和未转染的年轻大鼠来源EPC组。荧光显微镜下计数GFP阳性细胞数并计算转染效率;免疫荧光、RT-PCR和Western blotting检测Jagged1 mRNA和蛋白、von Willebrand因子（vWF）及血管内皮生长因子激酶插入区受体（KDR）mRNA表达,体外血管生成实验检测EPC的血管形成能力。结果：转染后Jagged1在EGFP-Jagged1组表达较对照组显著增强（P<0.01）;Jagged1过表达显著促进老龄大鼠EPC vWF与KDR mRNA表达（P<0.01）和体外血管生成能力（P<0.01）; vWF与KDR mRNA表达以及体外血管生成能力在Jagged1转染组与年轻大鼠EPC组间未见有显著差别。结论：Jagged1过表达促进内皮培养条件下老龄大鼠来源EPC向成熟内皮细胞分化。     

小鼠骨髓基质细胞的生物学特性及血管新生能力

目的 探讨体外培养的骨髓基质细胞的一些生物学特性及体内移植后在缺血区新血管生成中的作用。方法分离5—6周龄的小鼠胫骨、股骨，用预冷的DMEM／F12培养基冲洗出骨髓，经密度梯度离心分离出骨髓单个核细胞，接种后12～16d形成单层贴壁的成纤维样细胞。体外诱导分化鉴定分离的细胞，用传代的细胞进行生长曲线测定，观察其接种贴壁率、分裂指数，检测细胞周期和超微结构，并建立下肢缺血模型。荧光标记的体外扩增的骨髓单个核细胞被移植入缺血组织。移植后2周，荧光显微镜及内皮细胞碱性磷酸酶染色，检查荧光阳性细胞与染色阳性细胞的时空关系。结果体外传代培养的单个核细胞倍增时间约为42h。传代10h贴壁率达90％以上。分裂指数曲线与生长曲线相似。细胞周期显示约83％的细胞处于G1期。结论 体外培养的骨髓基质细胞生长稳定，传代后的细胞适应性强，增殖较快，表现出较早期细胞特点，在体外及移植入体内缺血区能分化为血管内皮细胞，有望用于改善组织缺血。     

小鼠骨髓基质细胞参与缺血组织血管再生及时相关系

目的探讨体外培养的骨髓基质细胞体内移植后在缺血区新血管生成中的作用及其时相关系.方法分离5～6周龄的小鼠胫骨、股骨,用预冷的DMEM/F12培养基冲洗出骨髓,经密度梯度离心分离出骨髓单个核细胞体外培养.体外成内皮细胞诱导分化鉴定分离的细胞,建立下肢缺血模型,荧光标记的体外扩增的骨髓基质细胞移植入左侧缺血组织,右侧注射等量培养介质作为对照组,分为7d、14d、28d 3个观察期(n=6),冰冻切片荧光显微镜观察,毗邻切片HE及vWF染色,检查荧光阳性细胞与染色阳性细胞的时空关系,并计算移植前后毛细血管密度的变化.结果体外分离培养的骨髓基质细胞在成内皮细胞供及物存在条件下表达vWF,并分泌NO.移植后7d,观察到大量分散开来的DAPI标记细胞存活(蓝色荧光),毗邻切片HE染色显示了高密度HE染色阳性区和荧光阳性区的一致性,MSC来源的供体细胞核浆比大,提示是较幼稚细胞,移植区未见明显炎症反应.移植后14d,组织切片可见大量荧光标记细胞存活,呈与骨骼肌直径大小相似的网状散在分布,对照组未见荧光,在毗邻的切片,大部分荧光阳性细胞vwF因子染色阳性,毗邻切片的HE染色,细胞移植组骨骼肌纤维未见明显异常,而对照组骨骼肌可见部分肌纤维变性.移植的28d,移植组毛细胞血管数量为(57±18)mm2,对照组为(36±12)mm2,移植组高于对照组(P＜0.05).结论体外培养的骨髓基质细胞在体外能够定向分化为血管内皮细胞,移植入体内缺血区能促进缺血区新血管生成,可望用作组织缺血细胞治疗的种子细胞.     

阿司匹林对大鼠缺血心肌血管生成及内皮祖细胞动员的影响

目的观察阿司匹林对大鼠缺血心肌血管生成和内皮祖细胞(endothelial progenitor cells,EPCs)动员的影响和可能机制.方法实验大鼠分为正常对照组、假手术组、心肌缺血加大剂量阿司匹林组、心肌缺血加小剂量阿司匹林组和单纯心肌缺血组.心肌缺血组和假手术组于术后一周从心腔内取血测血管内皮生长因子(VEGF),外周血分离单个核细胞培养计数EPCs,28 d后取缺血区心肌免疫组化法测毛细血管密度.结果单纯心肌缺血组和假手术组与正常对照组相比,血浆VEGF显著增多[(101.51±16.97)、(94.67±11.78)vs(80.07±10.32),(P＜0.05)];心肌缺血加小剂量阿司匹林组与正常对照组相比,外周血EPCs显著增多[(42±7)vs(20±6),(P＜0.05)];单纯心肌缺血组与正常对照组相比,毛细血管密度显著增加[(600±104)vs(431±73),(P＜0.05)];大剂量阿司匹林抑制了因缺血导致的VEGF、EPCs和毛细血管密度的增加分别由缺血时的(101.51±16.97)、(46±9)、(600±104)降至(70.76±10.15)、(23±6)、(431±80),(P＜0.05).结论大剂量阿司匹林可通过抑制VEGF的表达,抑制大鼠缺血心肌的血管生成和因缺血和损伤导致的EPCs的动员.     

Jagged1真核表达质粒构建及其对VSMC增殖凋亡的影响

目的:构建大鼠Jagged1真核表达质粒,探讨Jagged1对血管平滑肌细胞(VSMC)增殖和凋亡的影响。方法:大鼠Jag-ged1真核表达质粒重组构建及鉴定:XbaⅠ酶切含全长大鼠Jagged1基因的质粒pBOS-SN3T,获得目的基因片段,胶回收后定向连接至线性化的真核表达载体质粒pCMV-IRES-GFP中,得重组质粒,命名为p-Jagged1。组织块法培养大鼠主动     

辛伐他汀对大鼠平滑肌祖细胞和内皮祖细胞增殖的影响

目的 观察辛伐他汀对平滑肌祖细胞(SPC)和内皮祖细胞(EPC)增殖的影响,筛选新一代包被洗脱支架药物. 方法 采用密度梯度离心法从大鼠骨髓获取单个核细胞,将其接种在纤维连接素包被培养板,加入小同浓度辛伐他汀(0.01～10.00μmol/L)培养6～48 h后,平滑肌肌动脉蛋白免疫荧光染色鉴定骨髓源性SPC,激光共聚焦显微镜鉴定异硫氰酸荧光素结合的植物凝集素(FITC-UEA-I)和DiI结合的乙酰化低密度脂蛋白(DiI-acLDL)双染阳性细胞为正在分化的EPC,并在倒置荧光显微镜下计数. 结果 辛伐他汀显著抑制骨髓源SPC增殖,0.01μmol/L辛伐他汀作用24 h,SPC数量减少了(5.8±3.1)%(对照组与0.01μmol/L辛伐他汀组分别为4070±184与3833±126,P<0.05).辛伐他汀可促进EPC增殖,其促进作用随辛伐他汀浓度增加及作用时间延长而增加,1.00μmol/L辛伐他汀作用24 h EPC数量增加(2.0±0.1)倍(对照组与1 μmol/L辛伐他汀组分别为1249±146与3762±138,P<0.01). 结论 辛伐他汀抑制SPC增殖,促进EPC增殖,局部应用有抑制再狭窄和促进损伤血管再内皮化可能.     

晚期糖基化终末产物刺激下内皮细胞活性氧的变化及来源分析

目的探讨晚期糖基化终末产物刺激下内皮细胞活性氧的变化及来源。方法培养人脐静脉内皮细胞,观察不同浓度和不同作用时间晚期糖基化终末产物刺激下人脐静脉内皮细胞内活性氧的生成情况,进而分别应用线粒体呼吸链酶复合体、黄嘌呤氧化酶、一氧化氮合酶及NADPH氧化酶抑制剂,观察抑制相应氧化酶后细胞内活性氧的变化,分析各种氧化酶作用大小。结果晚期糖基化终末产物刺激后,内皮细胞内活性氧明显增加,并且随晚期糖基化终末产物浓度和孵育时间的增加而增加,NADPH氧化酶抑制剂二亚苯基碘几乎完全抑制了晚期糖基化终末产物刺激下细胞内活性氧的生成,线粒体呼吸链酶复合体I抑制剂鱼藤酮、线粒体呼吸链酶复合体Ⅱ抑制剂噻吩甲酰三氟丙酮、线粒体呼吸链酶复合体Ⅲ抑制剂抗霉素A、黄嘌呤氧化酶抑制剂别嘌醇对活性氧生成无明显影响,而一氧化氮合酶抑制剂左旋硝基精氨酸甲酯反而引起细胞内活性氧的轻度增加。结论NADPH氧化酶是晚期糖基化终末产物刺激下内皮细胞活性氧生成的主要来源,可能是晚期糖基化终末产物启动和加重动脉粥样硬化病理生理过程中的重要防治靶点。     

雌二醇调控小鼠内皮祖细胞凋亡及体外血管新生研究

目的 观察雌二醇(estradiol,E2)对体外培养骨髓来源内皮祖细胞(endothlial progenitor cells,EPCs)分化及凋亡的影响.方法 密度梯度离心法获取骨髓单个核细胞,流式细胞分析、FITC-荆豆凝集素Ⅰ、DiI-乙酰化低密度脂蛋白荧光双染鉴定.单个核细胞培养7 d后进行实验分为对照组、0.01 μmol/L E2组、0.1 μmol/L E2组、1 μmol/L E2组.分别采用流式细胞仪、体外管型生成实验观察EPCs的凋亡及体外血管新生的变化.结果 雌二醇治疗组体外血管新生实验评分分别为0.01 μmol/L组(2.91±0.70);0.1 μmol/L组(4.04±0.66); 1 μmol/L组(4.73±0.48),较对照组(2.13±0.59)均明显增加(P<0.01);流式细胞仪检测过氧化氢诱导的雌二醇治疗组EPCs凋亡率分别0.1 μmol/L组[(0.24±0.01),(P<0.05)]; 1 μmol/L组[(0.21±0.02),(P<0.01)],较对照组(0.29±0.02)明显降低;0.01 μmol/L雌二醇治疗后EPCs凋亡率无明显变化[(0.27±0.03),(P＞0.05)].结论 E2可抑制EPCs凋亡、促进EPCs体外血管新生.