bcr/abl基因b3-a2型接合区cDNA的分离和序列分析

利用分子生物学方法,我们将K562细胞林bcr/abl mRNA 0.3kb的接合区cDNA片段用聚合酶链反应扩增并插入到质粒pGEM-4-Z载体中。经限制酶切分析和荧光标记M13引物法DNA序列测定,证实重组质粒pB3A2中有0.3kb的插入片段与K562 mRNA接合区序列完全一致。我们分离到的接合区DNA可用于bcr/abl基因的检测及其反义核酸抑制的研究。     

特异性抗细胞表面分子单链抗体的分离和鉴定

目的：从抗KG1a细胞的噬菌体展示文库中分离和鉴定抗造血干/祖细胞表面分子单链抗体（scFv）,克隆其基因并研究其对应抗原在不同细胞表面的分布。方法：用完整的KG1a细胞吸附法富集文库3轮,再用CD44单克隆抗体为引导分子进行引导选择,分离单克隆后用间接免疫荧光法鉴别其细胞结合特异性。对具有不同细胞结合特异性的克隆进行DNA序列分析,用一级结构不同的单链抗体作免疫印迹鉴别抗原分子量。结果：间接免疫荧光结果显示,64个阳性克隆分别识别不同的细胞系,分属3种细胞结合谱,DNA序列测定结果证明C95、H1两个克隆具有独特的一级结构,利用Westernblot成功测定它们特异性识别KG1a细胞膜蛋白的表观分子量分别为34kD/22kD。结论：成功建立了分离和鉴定抗细胞表面分子phage-scFv单克隆的方法,并从抗KG1a细胞的噬菌体展示文库中分离出2个抗造血干/祖细胞的特异性克隆。     

单链抗体分子与链亲和素融合蛋白的制备

研究了抗人纤维蛋白单链抗体分子scFV-8E5与链亲和素融合蛋白的制备。链亲和素拼接在scFV-8E5 cDNA的3’端,制备的融合蛋白单体分子量约45kD。表达产物少数为周质间可溶型蛋白,多数为包涵体。无论是可溶型的蛋白产物或从包涵体中回收并复性的蛋白产物均有结合人纤维蛋白和生物素的功能。这个双特异性融合蛋白的成功制备证明了在scFV-8E5的3’端拼接其它效应分子的可行性。     

抗人纤维蛋白单链抗体重链可变区的人源化

目的人源化抗人纤维蛋白单链抗体的重链,降低人抗鼠抗体反应。方法从基因文库中挑选到与鼠源抗人纤维蛋白单链抗体重链（ＶＨ－８Ｅ５）同源性７１．８％的人源免疫球蛋白ＨＵＭＨＣＨ１０９重链（ＶＨ）序列,作为人源化改造ＶＨ－８Ｅ５的框架。人工合成人源化ＶＨ－８Ｅ５片段,用连接酶连接成完整的人源化ＶＨ－８Ｅ５,构建表达载体ｐＯＰＥ１０１－ＶＨ－８Ｅ５。转化ＪＭ１０９后用异丙基－β－Ｄ－硫代半乳糖苷诱导表达。结果经聚丙烯酰胺电泳和ＥＬＩＳＡ证明表达产物相对分子质量３０×１０３左右,有特异性识别和结合人纤维蛋白能力,是亲本抗体ＳｃＦｖ－８Ｅ５活性的４／５左右。人源化ＳｃＦｖ－８Ｅ５表达产量为转化菌总蛋白的１１．２％。结论人源化ＶＨ－８Ｅ５仍具有特异性识别人纤维蛋白的活性,ＳｃＦｖ－８Ｅ５重链的人源化基本获得成功     

抗人纤维蛋白单链抗体-链亲和素融合蛋白的稳定性及对动物纤维蛋白的识别

目的：探索抗人纤维蛋白单链抗体链亲合素融合蛋白的应用前景。方法：构建抗人纤维蛋白单链抗体ｓｃＦｖ８Ｅ５基因与链亲和素基因的重组表达载体ｐＳＴＥ２８Ｅ５ ,表达的融合蛋白可特异性识别人纤维蛋白,同时有生物素的结合位点。转化ＪＭ１０９ 后用ＩＰＴＧ 诱导表达,ＥＬＩＳＡ 观察融合蛋白的稳定性。结果：抗人纤维蛋白单链抗体链亲合素融合蛋白稳定性好,可耐受至少２ ｗ ,４ ℃保存、数次反复冻融或一定时间的３７ ℃孵育。它能与大鼠和豚鼠的纤维蛋白结合,而与猪纤维蛋白反应不明显。结论：抗人纤维蛋白单链抗体链亲和素融合蛋白适用于大鼠或豚鼠血栓病模型,是临床前研究的有用材料。     

BaHM细胞匀浆第3组分对照射小鼠的骨髓细胞及人GM-CSF依赖细胞系MO7e增殖的影响

B3HM细胞系可以致小鼠白血病。为了进一步寻找致病物质,将B3HM细胞经超声波匀浆后,差速离心分成四个组分,分别注射于经^137Cs4．5Gy照射的615或BALB／c小鼠。结果显示,第3组分含致病活性物质。经与B3HM细胞第3组分共孵育后的MO7e细胞对GM-CSF依赖性明显减弱,并能生成自发性L-CFU。在SDS-PAGE胶上B3HM细胞第3组分显示一条分子量约36kD的蛋白带。经制备电泳分离的5条蛋白带中3条带对GM-CSF因子依赖细胞系MO7e有一定促增殖作用。B3HM细胞使经照射处理的小鼠血细胞发生恶性转化的活性物质可能与这些表达蛋白有关。     

单链抗体-碱性磷酸酶融合蛋白的制备

目的：制备单链抗体-碱性磷酸酶融合蛋白。方法：把碱性磷酸酶编码区插入pSTE2-8E5质粒DNA，用scFvC66的重链和轻链可变区DNA取代scFv-8E5的重链和轻链可变区DNA，构成表达载体pSTE2-C66-Ap在大肠杆菌中表达，用聚丙烯酰胺凝胶电泳和免疫印迹法分析产物活性。结果：获得一个分子量为75kD的scFvC66-Ap融合蛋白，可结合来自KGla细胞裂解物中的一个分子量约60kD的蛋白质带，其结合功能可通过其碱性磷酸酶活性直接测定。结论：建立了一个用大肠杆菌制备单链抗体-碱性磷酸酶融合蛋白的方法，它可能取代常规的碱性磷酸酶标记方法而用于免疫检测。     

髓系造血生长因子与临床应用

近10年来,细胞因子的研究日益受到学术界的重视,越来越多的生长因子被发现、分离提纯和基因克隆。生长因子种类虽然多,但有一些共同特点:①它们大多为糖蛋白;②多种细胞均可分泌;③每个因子都有自己的靶细胞;④细胞因子作用的靶细胞上有相应的受体,它们或是固有的,或是诱导形成的;⑤凡具备因子受体的细胞一般都可以对因子起反应。一个因子一个效应的概念已被否定。骨髓中造血细胞的生长和分化需要各种造血生长因子,其中作用于髓系造血细胞的主要为集落刺激因子(CSF)。根据其作用的靶细胞不同分GMCSF、G-CSF、M-CSF、Multi—CSF(IL-3)等。由于基因工程技术的应用,这些因子的基因重组使表达产物已广泛用来研究其生物活性,并已开始用于临床。本     

来自噬菌体抗体库识别KG1a细胞的scFv5C1的高效表达、纯化及其生物学特性

目的为深入研究源于噬菌体抗体库特定单链抗体（scFv）的功能和其识别抗原的分子特征,将识别KG1a细胞的单链抗体5C1scFv高效表达、纯化;用scFv测定未知抗原的相对分子质量（Mr）;并研究5C1scFv对KG1a部分细胞生物学特性的影响。方法基因重组构建表达5C1scFv的载体pSTE-5C1,在大肠杆菌中诱导表达,金属离子螯和亲和层析法纯化,获得高纯度的活性5C1scFv;借助生物素-链亲和素的高亲和力和高灵敏度的显色系统,用Westernblot分析其识别的KG1a细胞膜蛋白的Mr;用聚集实验分析5C1scFv对KG1a细胞同型聚集的影响。结果5C1scFv在大肠杆菌中获高效表达,纯化后活性蛋白产量可达每升培养物50～60mg,纯度大于95%;成功地测定了其识别抗原的Mr为（85.0/124.5）×103;并确认5C1scFv以浓度依赖方式抑制KG1a细胞的同型聚集。结论高效表达纯化的5C1scFv特异性识别Mr为（85.0/124.5）×103的KG1a细胞膜表面分子,此分子可能是一种在KG1a细胞表面表达的参与细胞同型聚集的分子或受体。这些结果为进一步深入研究抗原本质及克隆抗原分子基因奠定了良好的基础。     

人及小鼠干细胞因子cDNA克隆的分离与鉴定

干细胞因子(SCF)是作用于早期多能造血干细胞的调控因子。不同的作者对这种因子有不同的命名,然而它们的生物学作用相同,都是c—kit编码蛋白的配体,它们的cDNA序列基本相同,因而证明是同一种物质。我们利用RT-PCR方法,从我室自己建立的三株基质细胞系中扩增出SCF活性部分的cDNA序列,并成功地克隆入载体,为进一步表达SCF并探索它的生物学新功能和作用机制提供了保证。