EA-IL-15溶瘤腺病毒的构建及其对胶质瘤细胞特异性及有效性研究

目的 构建插入EA-IL-15双基因的溶瘤腺病毒(oAD-EA-IL-15),探讨其在体外对胶质瘤细胞的杀伤效果和特异性。方法 PCR法将EA-IL-15双基因插入腺病毒穿梭载体pXC1,将穿梭质粒pXC1-EA-IL-15及辅助质粒pBHG loxΔE1,3 Cre质粒共转染HEK393细胞,获得溶瘤腺病毒oAD-EA-IL-15。通过CCK-8细胞毒性实验,测定细胞相对活性,绘制剂量反应曲线。结果 成功构建溶瘤腺病毒载体(oAD)及含EA-IL-15双基因的溶瘤腺病毒载体(oAD-EA-IL-15);体外包装获得相应的溶瘤腺病毒oAD和oAD-EA-IL-15;oAD对小鼠胶质瘤细胞GL261有明显杀伤作用(P＜0.05),对小胶质细胞BV2(非肿瘤细胞)的杀伤作用明显低于对GL261(P＜0.05),说明oAD具有特异性;oAD-EA-IL-15和oAD分别感染GL261、BV2细胞,对于GL261,oAD-EA-IL-15的半抑制浓度(IC₅₀)值为0.58×10⁷±1.30×10⁵ PFU/ml较oAD的IC₅₀值1.13×10⁷±1.98×10⁵PFU/ml低,对肿瘤细胞的杀伤作用强于oAD(P＜0.01),对于BV2,oAD-EA-IL-15对其活性的影响低于oAD(P＜0.01),说明oAD-EA-IL-15病毒的特异性优于oAD病毒。结论 携带EA-IL-15双基因的溶瘤腺病毒在体外对胶质瘤细胞具有明显的杀伤作用和特异性,可为胶质瘤治疗提供更加特异有效的途径。     

BTN3A3低表达促进肝细胞癌的恶性进展

目的 初步探讨BTN3A3在肝细胞癌(hepatocellular carcinoma, HCC)恶性进展中的作用。方法 统计分析BTN3A3基因在不同分期肝癌组织中的表达情况;采用Kaplan-Meier法分析BTN3A3基因表达水平对肝癌患者生存期的影响。在HLE及HepG2肝癌细胞系中敲减BTN3A3的表达后,分析细胞的迁移、侵袭和克隆形成能力的变化。结果 通过对TCGA数据库统计分析发现,Ⅳ期肝癌患者中BTN3A3基因的表达量降低;生存曲线分析表明,低表达BTN3A3基因的肝癌患者整体生存期显著缩短。肝癌细胞系体外迁移实验表明,降低BTN3A3表达后促进肝癌细胞系的迁移;侵袭实验表明,降低BTN3A3表达后促进肝癌细胞系的侵袭;降低BTN3A3表达后肝癌细胞系克隆形成能力增强。结论 本研究初步明确了减少BTN3A3的表达能够促进HCC的恶性进展,有助于对BTN3A亚家族蛋白质功能的了解,为发展新的高级别HCC的分子治疗靶点提供线索。     

脑胶质瘤U251多倍体巨细胞的构建及其对替莫唑胺的耐药性研究

目的探讨脑胶质瘤U251多倍体巨细胞的体外构建方法并研究其对替莫唑胺的耐药性。方法通过慢病毒感染实验观察带有不同荧光标记的人脑胶质瘤U251细胞;采用植物血凝素-聚乙二醇融合法进行细胞融合;通过流式细胞分选实验检测体外携带双色荧光标记的胶质瘤多倍体巨细胞;采用碘化丙啶染色方法测定U251融合克隆细胞的DNA含量;通过CCK-8实验评价细胞的增殖率以及加入替莫唑胺后细胞的存活率。结果慢病毒感染实验成功获得分别带有绿色和红色荧光标记的胶质瘤U251细胞;细胞融合后显微镜下可见携带双色荧光的胶质瘤融合细胞,并且与聚乙二醇细胞融合法比较,植物血凝素-聚乙二醇细胞融合法的细胞融合率明显提高(自<1%提高至>5%)。流式细胞分选获得胶质瘤U251融合细胞单克隆株。DNA含量的检测结果显示,U251融合克隆细胞的DNA含量自之前的2N/4N提高至4N/8N。CCK-8实验结果显示,U251细胞接种后1、2、3、4及5 d的细胞增殖率分别为(99.5±2.6)%、(236.7±4.7)%、(348.9±8.8)%、(656.5±18.5)%及(715.7±48.2)%;而U251-C1多倍体巨细胞的细胞增殖率分别为(100.6±2.1)%、(114.5±1.3)%、(138.4±1.7)%、(316.7±23.1)%及(347.7±13.1)%,U251-C2多倍体巨细胞的细胞增殖率分别为(100.3±1.2)%、(114.7±1.2)%、(186.4±0.6)%、(307.1±9.5)%及(432.9±37.7)%,相较于胶质瘤U251细胞,U251多倍体巨细胞的不同克隆株(U251-C1、U251-C2)的增殖速度均明显减慢(均P<0.05)。替莫唑胺作用下,U251细胞和U251多倍体巨细胞(U251-C1、U251-C2)的细胞存活率均下降(均P<0.01),而与U251细胞组比较,不同U251多倍体巨细胞株(U251-C1、U251-C2)的细胞存活率均更高(均P<0.01)。结论植物血凝素-聚乙二醇细胞融合法可在体外成功构建脑胶质瘤U251多倍体巨细胞;胶质瘤U251多倍体巨细胞可能对替莫唑胺的耐药性发挥重要作用。