地钱素C衍生物F41对子宫颈癌HeLa细胞凋亡的影响

目的对地钱素C(MC)羟基衍生物进行筛选,寻找具有高抗肿瘤活性的MC衍生物,并初步探讨其抗肿瘤的细胞与分子生物学机制。方法用MTT法观察56种MC羟基衍生物对子宫颈癌HeLa细胞的毒性作用,筛选其中细胞毒作用最强的MC衍生物,并比较其与MC对HeLa细胞存活的抑制作用。用倒置显微镜、DAPI染色和DNA梯带检测其对细胞凋亡的影响。用流式细胞术检测其对细胞周期的影响。用Western印迹法检测其对细胞周期和凋亡相关蛋白表达的影响。结果在56种MC衍生物中,F41对HeLa细胞毒性最强,抑制HeLa细胞存活的IC50为(11.31±2.13)μmol·L-1,明显低于MC〔IC50为(17.19±3.28)μmol·L-1〕(P<0.01)。F41和MC与HeLa细胞作用24,48和72h,F41对HeLa细胞存活的抑制作用均明显强于MC(P<0.05)。形态学和DNA梯带检测显示,F41处理后,HeLa细胞皱缩变小,有空泡和凋亡小体出现,胞核浓缩变小,DNA电泳呈梯状条带。流式细胞分析显示,F41 15μmol·L-1处理HeLa细胞24h,G2/M期细胞占总细胞的比例为(43.8±3.0)%,明显高于对照组的(13.1±1.6)%(P<0.01);G1期细胞比例为(34.8±3.8)%,明显低于对照组的(63.6±5.5)%(P<0.01)。Western免疫印迹结果表明,F41可使HeLa细胞内磷酸化细胞周期蛋白依赖性蛋白激酶1水平降低,细胞周期蛋白B1和P53蛋白表达增多。结论 F41可诱导HeLa细胞凋亡,抑制HeLa细胞分裂,其抗肿瘤活性可能强于MC。     

N-乙酰半胱氨酸对子宫颈癌细胞紫杉醇耐药性的影响

目的   建立耐紫杉醇(PTX)子宫颈癌细胞株,观察N-乙酰半胱氨酸(NAC)对子宫颈癌细胞紫杉醇耐药的影响。方法   用PTX处理并培养Hela细胞,建立耐PTX子宫颈癌细胞株Hela/PTX。观察和检测其细胞形态、细胞生长曲线、耐药指数、氧化还原状态及紫杉醇耐药基因1(Txr1)的表达。用NAC处理Hela/PTX细胞,观察NAC对其PTX耐药的影响。结果   用PTX处理Hela细胞10个月后, 可获得在500μg/L PTX中生长状态良好的Hela/PTX细胞。Hela/PTX细胞体积偏大,胞浆内颗粒较多,群体倍增时间是亲代细胞的1.32倍, 对PTX具有显著耐药性,耐药指数为122.69。与Hela细胞相比,Hela/PTX细胞有高水平的活性氧(ROS)和Txr1 mRNA,但还原型谷胱甘肽(GSH)水平及超氧化物歧化酶、过氧化氢酶和谷胱甘肽过氧化物酶活性却有不同程度的降低,而氧化型谷胱甘肽(GSSG)水平和GSH/GSSG比值则无明显变化。NAC处理后,Hela/PTX细胞ROS和Txr1 mRNA水平下降,对PTX敏感性增加。结论   耐紫杉醇Hela/PTX细胞氧化还原状态失衡,Txr1表达增加。NAC能降低ROS水平,减少Txr1表达,可逆转其对PTX的耐受。     

人参皂苷Rb1对NEP基因启动子活性的影响

目的 构建NEP启动子缺失体-荧光素酶报告基因质粒,探查神经内肽酶(NEP)基因启动子中与人参皂苷Rb1影响NEP启动子活性有关的位点。方法 用NEP基因5′上游启动区2.4kb片段和荧光素酶报告基因载体pGL3-basic构建NEP启动子-荧光素酶报告基因质粒pGL3-nep2.4;用Erase-a-Base System对pGL3-nep2.4质粒2.4kb DNA插入片段5′端进行缺失,构建NEP启动子缺失体-荧光素酶报告基因质粒;用Rb1处理NEP启动子缺失体转染的人神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞,检测双荧光素酶活性,观察Rb1对NEP启动子活性的影响。结果 成功构建了含NEP启动子DNA序列的重组质粒pGL3-nep2.4。荧光素酶活性检测显示,转染pGL3-nep2.4质粒的SH-SY5Y细胞荧光素酶活性是转染pGL3-basic的13.1倍(P<0.01)。Rb1处理可使转染pGL3-nep2.4质粒的SH-SY5Y细胞荧光素酶活性增加,其是对照组的2.9倍(P<0.01);细胞荧光素酶活性检测亦显示,NEP基因上游启动区-894~-857bp(Region Ⅰ)及-100~-82bp(Region Ⅳ)片段缺失后,启动子活性分别是缺失前的29%(P<0.01)和25%(P<0.01),-559~-534bp(Region Ⅱ)及-223~-179bp(Region Ⅲ)片段缺失后,启动子活性分别是缺失前的5.12倍(P<0.01)及1.81倍(P<0.01)。Rb1处理后,RegionⅠ、Ⅱ和Ⅲ缺失体质粒转染细胞荧光素酶活性均与对照组无统计学差异(P>0.05),Region Ⅳ缺失质粒pGL3-226转染细胞荧光素酶活性也与对照组无明显差异(P>0.05),而含Region Ⅳ质粒pGL3-244转染细胞荧光素酶活性则是对照组的1.61倍(P<0.01)。结论 NEP基因5′上游2.4kb DNA片段有较强的启动子活性,Rb1能明显增加其活性。NEP基因2.4kb DNA片段有2个正调控区(RegionⅠ和Region Ⅳ)和2个负调控区(RegionⅡ和Region Ⅲ),Rb1通过Region Ⅳ发挥正调控作用。