靶向敲减KLF4基因的重组腺相关病毒载体的构建及其在肺动脉高压动物模型中的应用

目的 构建靶向敲减KLF4基因的重组腺相关病毒载体,并应用于肺血管疾病,为后期研究肺血管KLF4基因敲减在肺动脉高压大鼠中的作用及相关分子机制奠定基础。方法 根据大鼠KLF4基因序列,设计针对大鼠特异性的siRNA序列,以pHBAAV-U6-MCS-CMV-EGFP作为空白载体,通过酶切技术构建带有GFP荧光标记的KLF4干扰腺病毒载体pHBAAV-r-KLF4 shRNA-GFP,行测序分析,并进行病毒扩增、纯化及滴度测定。本研究对长时间（3个月）接触香烟烟雾的大鼠进行气道注入AAV1-KLF4-shRNA的干预治疗,观察大鼠右心室收缩压、平均右心室压等血流动力学指标改变。结果 经测序检测显示,大鼠AAV1-KLF4-shRNA腺相关病毒载体构建成功。健康对照组、生理盐水模型组、对照病毒模型组、治疗干预组的右心室收缩压和平均右心室压比较,差异均有统计学意义（P <0.05）。结论 对长时间接触香烟烟雾的肺动脉高压模型大鼠应用AAV1-KLF4-shRNA腺相关病毒载体,能有效改善右心室收缩压和平均右心室压,该载体在相关疾病动物模型中应用有效,为后期顺利开展AAV1-KLF4-s...     

树突细胞及其相关趋化因子受体在慢性阻塞性肺疾病大鼠肺部的表达变化及其意义

目的 了解树突细胞（DC）及其趋化因子受体CCR6、CCR7在慢性阻塞性肺疾病（COPD）大鼠肺部的表达变化,并探讨其意义。方法 选用20只清洁级健康Wistar大鼠,采用随机数字表法分为健康对照组（10只）和COPD组（10只）。COPD组使用香烟烟雾刺激和气道内注入脂多糖（LPS）的方法制备COPD模型。第29天取大鼠肺组织,制作病理切片,行HE染色观察其病理学改变;采用免疫组织化学技术检测肺部OX+62DC、CD+83DC的表达水平,酶联免疫吸附试验（ELISA）法检测支气管肺泡灌洗液（BALF）中CCR6和CCR7的表达水平。结果 COPD组大鼠肺组织HE染色符合COPD典型病理表现,OX62和CD83的阳性染色均主要表达于细胞的胞质,呈棕黄色。COPD组OX+62DC表达水平高于健康对照组,CD+83DC表达水平低于健康对照组,差异均有统计学意义（P＜0.01）。COPD组BALF中CCR6表达水平高于健康对照组,CCR7表达水平低于健康对照组,差异均有统计学意义（P＜0.01）。结论 DC及其趋化因子受体CCR6在COPD大鼠肺部增多,而成熟DC及其趋化因子受体CCR7在COPD大鼠肺部减少。     

慢性阻塞性肺疾病大鼠外周血及支气管肺泡灌洗液中CCR6、CCR7的变化及意义

目的:了解树突状细胞的趋化因子受体CCR6、CCR7在COPD大鼠外周血和支气管肺泡灌洗液(BALF)中的变化。方法:选用20只健康Wistar大鼠,随机分为正常对照组(10只)、COPD模型组(10只),采用两次气道内注入细菌内毒素脂多糖(LPS)和连续被动吸烟4周的方法建立COPD大鼠模型。第28天处死两组大鼠。取大鼠肺脏组织用石蜡包埋HE染色以观察肺组织病理学改变,酶联免疫法(ELISA)检测BALF及外周血中CCR6、CCR7的含量。结果:COPD模型组大鼠一般状况较正常对照组大鼠差,体重显著减轻模型组(242.31±14.71)g,对照组(324.18±12.89)g,差异具有统计学意义P0.05),HE染色提示慢性阻塞性肺疾病的特征性病理改变。BALF中CCR6含量在COPD模型组(105.81±2.73)ng/L明显高于正常对照组(43.57±5.51)ng/L,差异具有高度统计学意义(P0.01),CCR7的含量在COPD模型组(10.40±3.07)ng/L低于正常对照组(41.73±7.40)ng/L,差异具有高度统计学意义(P0.01)。两组大鼠外周血中CCR6含量模型组(264.89±45.34)ng/L,对照组(311.12±29.78)ng/L、CCR7含量模型组(73.77±29.71)ng/L,对照组(56.42±15.30)ng/L均无统计学差异(P0.05)。结论:COPD大鼠肺组织病理符合人COPD特征性病理改变,提示COPD大鼠模型建立成功。树突状细胞趋化因子受体CCR6在COPD大鼠肺部明显增多,而成熟树突状细胞趋化因子受体CCR7在COPD大鼠肺部减少。     

慢阻肺大鼠肺组织中树突状细胞表面因子的表达变化及CCL20抗体的干预作用

目的了解树突状细胞表面因子OX62、CD83在慢阻肺大鼠肺部的表达变化,并探讨CCL20抗体的干预作用。方法选用30只健康Wistar大鼠,随机分为健康对照组(10只)、慢阻肺模型组(10只)、CCL20单抗组(10只),用气道内注入脂多糖(共2次)联合烟雾刺激(约28 d)的方法诱导慢阻肺模型。在实验初始对单抗组大鼠以CCL20单克隆抗体腹腔注射一次。在第29天取大鼠的肺组织观察其病理学改变,用免疫组织化学技术检测肺部树突状细胞(DC)的表面因子OX62、CD83的表达变化。结果模型组大鼠肺组织HE染色符合气道炎症和肺气肿的表现,CCL20单抗组大鼠肺部病理表现比慢阻肺组明显减轻。与健康对照组相比,慢阻肺模型组大鼠的肺组织中OX62的表达比对照组明显增多(P0.05),而在CCL20单抗组低于慢阻肺组(P0.05)。慢阻肺模型组大鼠肺组织中CD83的表达比对照组少(P0.05),而在慢阻肺组与CCL20单抗组之间则没有明显的差异(P0.05)。结论慢阻肺的发病可能与肺部OX62的表达增多及CD83的表达减少有关,使用CCL20单抗能部分地抑制这一效应。     

CCL20抗体对慢性阻塞性肺疾病大鼠外周血和肺泡灌洗液中树突状细胞表面因子表达的影响

目的：研究CC亚族趋化因子配体20（CCL20）和树突状细胞（DCs）在慢性阻塞性肺疾病（COPD）发病过程中的作用及抗CCL20抗体治疗对COPD外周血和肺泡灌洗液（BALF）中DCs表面因子表达的影响。方法：选取雄性SPF级Wistar大鼠48只,随机分为正常对照组、COPD模型组和CCL20抑制组,每组16只。用烟熏及气道内滴注脂多糖（LPS）方法制备COPD大鼠模型。HE染色观察3组大鼠肺组织病理学改变。采用酶联免疫法(ELISA）检测3组大鼠BALF及外周血中CCL20的含量,流式细胞术（FCM）检测3组大鼠外周血和BALF中DCs各细胞因子（CD80、CD86、MHC-Ⅱ和OX-62）的百分比。结果：COPD组和CCL20抑制组大鼠肺组织HE染色均显示气道炎症和肺气肿表现,但后者气道炎症和肺气肿表现较前者减轻。与正常对照组比较,COPD组和CCL20抑制组大鼠外周血及BALF 中CCL20含量增加（P<0.05）;与COPD组比较,CCL20抑制组大鼠外周血中CCL20含量未见改变,但BALF中CCL20含量降低（P<0.05）。与正常对照组比较,COPD组大鼠外周血中CD80、CD86和OX-62百分比均升高（P<0.05）;与COPD组比较,CCL20抑制组大鼠外周血中CD86和OX-62百分比均降低（P<0.05）。与正常对照组比较,COPD组及CCL20抑制组大鼠BALF中CD80和CD86百分比均升高（P<0.05）;与COPD组比较,CCL20抑制组大鼠BALF中CD80百分比降低（P<0.05）。结论：CCL20参与了COPD的发病过程,CCL20抗体对该过程有一定的抑制作用。CCL20抗体可以减轻DCs在外周血中的增加和气道内的募集,从而延缓气道炎症或肺气肿的产生。     

香烟烟雾刺激诱导肺动脉高压动物模型的构建

目的 探讨利用单纯香烟烟雾刺激造模能否有效构建肺动脉高压疾病模型.方法 把20只清洁级SD大鼠,随机分为对照组(9只)、肺动脉高压(模型)组(11只),用香烟烟雾刺激的方法诱导肺动脉高压模型.在造模满4个月时检测各组大鼠血流动力学指标,取肺组织制作病理切片,比较两组大鼠的肺血管重构程度.结果 与对照组相比,模型组右室收...     

香烟烟雾所致肺动脉高压大鼠模型的肺小血管肌化程度及意义

背景　肺动脉高压是常见的肺血管疾病,香烟烟雾能否直接导致肺动脉高压目前存在争议,有研究发现部分吸烟人群在早期,甚至在肺功能仍正常且未发生明显缺氧表现时已发生肺小血管重塑,但是其中的具体机制尚不清楚。肺小血管的重塑是肺动脉高压的主要病理机制,有研究显示,实验小鼠的肺血管重塑与其肺小血管的肌化有关。目的　探讨单纯香烟烟雾所致肺动脉高压大鼠的肺小动脉肌化程度及意义。方法　2018年1-5月,选用16只健康SD大鼠,随机分为对照组、模型组各8只,用香烟烟雾刺激的方法诱导肺动脉高压模型,用时4个月。造模满4个月时,观察大鼠活动、饮食、毛发等一般状况并检测右心室收缩压和平均右心室压,计算右心室肥厚指数、右心室重量和体质量的比值（RV/BW）,免疫组织化学法检测肺小血管中α-SMA的表达以评估肺血管肌化程度（完全肌化、部分肌化、未肌化）。结果　造模4个月后,对照组大鼠活动、饮食、毛发等一般状况未见异常,而模型组大鼠明显表现出倦怠状态,常蜷缩于角落,不积极寻觅食物,毛发也变得比较枯黄。模型组大鼠右心室收缩压和平均右心室压高于对照组,体质量低于对照组（P<0.05）。模型组右心室肥厚指数和RV/BW高于对照组（P<0.05）。对照组大鼠的肺小血管肌化比例低于模型组（P<0.05）;模型组肺小血管中未肌化比例低于对照组,部分肌化和完全肌化比例高于对照组（P<0.05）。结论　香烟烟雾刺激可直接导致肺动脉高压,其发病可能与肺小动脉肌化程度加重有关。     

树突状细胞在慢性阻塞性肺疾病发病中的作用

树突状细胞（DC）是目前已知的功能最强的抗原提呈细胞,被认为是启动机体特异性免疫应答并对其加以调控和维持的中心环节,在肿瘤免疫、免疫排斥和抗感染免疫等方面发挥着极为重要的作用。近年来越来越多的研究显示慢性阻塞性肺疾病有可能也是一种"自身免疫性疾病",DC存在于慢性阻塞性肺疾病的病灶中,其数量和功能均发生了改变,相关的趋化因子及趋化因子受体也发生了变化,提示DC与慢性阻塞性肺疾病的发病机制有关。     

锌指样转录因子4在肺动脉高压中的研究进展

锌指样转录因子4(KLF4)是一种结构上保守的含锌指转录因子，可调控细胞生长、增殖及分化。KLF4是一种炎症反应调节因子，在血管重塑中发挥重要作用。KLF4通过调控平滑肌细胞表型转换、内皮功能障碍、炎症浸润等参与肺血管重塑。KLF4在血管重塑中的具体机制目前尚不明确，该文就KLF4在血管重塑中的作用展开综述。     

一种肺血管基因敲减动物模型的构建及在肺动脉高压中的运用

目的 探讨经大鼠的气道注入1型腺相关病毒（AAV1）携带的KLF4-shRNA能否有效构建肺血管基因敲减动物模型以及其在肺动脉高压中的运用。方法 根据大鼠KLF4基因序列，设计针对大鼠特异性的siRNA序列，并以细胞计数和细胞迁移实验加以验证，然后进一步构建AAV1-KLF4-shRNA腺相关病毒载体。将44只清洁级SD大鼠随机分为4组：健康对照组、盐水模型组、对照病毒载体组、基因敲减组。后3组大鼠分别气管内注入生理盐水（盐水模型组）、AAV1-control vector（对照病毒载体组）、AAV1-KLF4-shRNA（基因敲减组）。1个月后对后3组进行烟熏造模，烟熏4个月后麻醉各组大鼠，分别检测右心室收缩压和平均右心室压，并取肺组织以免疫荧光法观察病毒载体在肺血管中的表达情况，通过PCR方法测定肺动脉中KLF4水平，通过HE染色比较肺小血管中膜厚度评估肺血管肥厚程度。取大鼠心脏计算右心肥厚指数。结果 细胞计数和细胞迁移实验证实选用的KLF4-siRNA链有效。免疫荧光实验显示，经大鼠气道注入的1型腺相关病毒载体均沿肺血管分布。荧光定量PCR实验显示，基因敲减（AAV1-KLF4-...