FGF21[Tyr20]突变体的克隆、表达及纯化

目的：将成纤维细胞生长因子21(FGF21)第20位氨基酸进行突变后,在大肠杆菌中表达,并进行纯化和生物活性检测。方法：以野生型的FGF21为模板,将FGF21第20位氨基酸Tyr进行PCR定点突变成Phe后与小分子泛素样修饰物（SUMO）融合,克隆至pET22b表达载体中,构建重组原核表达质粒pET22b-SUMO-FGF21［Tyr²⁰］,克隆至BL21（DE3）,IPTG诱导表达,表达产物经SDS-PAGE电泳及Western blotting法进行鉴定,用Ni-NTA亲和层析柱纯化,SUMO蛋白酶将SUMO切除,Sephadex G-50除盐。结果：通过PCR定点突变,成功地将FGF21第20位氨基酸进行了突变,重组质粒pET22b-SUMO-FGF21［Tyr²⁰］经PCR和双酶切鉴定后测序与预期结果相符。经SDS-PAGE电泳分析,蛋白为可溶性,纯化后成功获得FGF21［Tyr²⁰］突变体蛋白,Western blotting分析显示FGF21［Tyr²⁰］突变体蛋白与FGF21抗体有特异性反应。结论：成功构建并高效可溶性表达SUMO-FGF21［Tyr²⁰］的突变体基因,获得FGF21［Tyr²⁰］蛋白。     

人成纤维细胞生长因子21基因的克隆及在毕赤酵母中的表达

目的：以毕赤酵母(Pichia pastoris) GS115和SMD1168为宿主菌表达人源成纤维细胞生长因子21（hFGF21）,为开发治疗糖尿病药物提供一定的实验基础。方法：根据毕赤酵母基因偏爱密码子和hFGF21氨基酸序列,设计多条寡核苷酸引物。利用融合PCR方法获得人工合成的成纤维细胞生长因子21(FGF21)基因,定向克隆到质粒pPIC9K中,电转化Pichia pastoris GS115和SMD1168。MD、MM平板筛选表型Mut⁺,YPD/G418平板进一步筛选高拷贝转化子。甲醇诱导表达,硫酸铵沉淀、分子筛、离子交换方法纯化目的蛋白。结果：PCR　扩增出约569 bp的特异性片段,测序分析正确;诱导表达上清经SDS-PAGE和Western blotting分析表明：FGF21在宿主菌GS115中不表达,而在SMD1168表达上清中出现相对分子质量为20 000的特异性条带,且与抗FGF21抗体产生特异性反应,阴性对照在该处无特异性带,证明hFGF21蛋白在SMD1168菌株中成功分泌表达。结论：成功克隆FGF21基因,并在Picha pastoris　SMD1168中获得表达。     

成纤维细胞生长因子-21对体外诱导的非酒精性脂肪肝细胞模型脂代谢的影响

目的：探讨成纤维细胞生长因子-21(FGF-21)对体外诱导的非酒精性脂肪肝（NAFLD）细胞模型脂代谢的影响及其可能的作用机制。方法：采用MTT法筛选医用脂肪乳注射液使用浓度和FGF-21作用浓度,将体外诱导的NAFLD细胞分为对照组、模型组、脱离脂肪乳组和FGF-21治疗组,光学显微镜观察油红O染色情况,全自动生化仪检测NAFLD细胞内甘油三酯(TG)水平,免疫细胞化学方法观察细胞内肉毒碱脂酰转移酶-1(CPT-1)、过氧化氢酶体增殖物激活受体γ(PPARγ)及固醇调节元件结合蛋白-1c（SREBP-1c）的表达。结果：MTT法筛选出0.1%医用脂肪乳注射液作为建立体外诱导NAFLD细胞模型的最佳诱导浓度,与正常肝细胞株HL7702比较,模型组油红O染色后细胞浆内有大量被染成橘红色的脂滴,细胞内TG水平显著升高（P＜0.01）,CPT-1蛋白表达减弱,PPARγ和SREBP-1c蛋白表达增加。MTT法筛选出0.5 mg/LFGF-21作为观察该药物对NAFLD细胞模型影响的作用浓度,与模型组比较,FGF-21处理组细胞内TG水平显著降低（P＜0.01）,CPT-1蛋白表达增加,PPARγ和SREBP-1c蛋白表达减弱。结论：FGF-21处理能减轻NAFLD细胞中TG蓄积,并使HL7702细胞CPT-1蛋白表达增加,而PPARγ和SREBP-1c蛋白表达减少。     

乙型肝炎患者血清及外泌体内HBV-DNA提取及检测的方法学研究北大核心CSCD

目的:比较煮沸法与苯酚-氯仿法提取血清及外泌体内HBV-DNA,Taqman法与SYBR法qPCR检测HBV-DNA表达的优缺点,并寻找更为准确敏感的诊疗参考指标。方法:收集高病毒载量组与低病毒载量组的血清,提取血清外泌体并鉴定,分别提取血清与外泌体内HBV-DNA,比较分析煮沸法与苯酚-氯仿法提取及qPCR Taqman法与SYBR法检测之间的表达差异。结果:高病毒载量组(HBV-DNA>5E+02 U/ml)中煮沸法提取血清HBV-DNA,Taqman法检测值高于SYBR法(P<0.05);Taqman测定血清HBV-DNA、SYBR测定外泌体HBV-DNA,煮沸法提取效率均高于苯酚-氯仿法(P<0.05);血清HBV-DNA表达高于外泌体(P<0.05)。低病毒载量组(HBV-DNA<5E+02 U/ml)中煮沸法与苯酚-氯仿法提取、Taqman法与SYBR法qPCR检测血清及外泌体HBV-DNA差异均无统计学意义。外泌体HBV-DNA表达高于血清(P<0.05)。结论:两种提取及检测方法均具有一致的灵敏度与特异度。外泌体包裹的HBV-DNA水平可能是临床诊断和治疗慢性乙肝中不可或缺的关键因素。