中国恒河猴DNGR-1分子C型凝集素样结构域在大肠杆菌系统表达

目的获得恒河猴C型凝集素结构域家族9的A成员(Clec9A)基因编码区序列;体外表达CLEC9A的C型凝集素样结构域(CTLD)。方法利用Clec9A基因特异引物,反转录PCR扩增中国恒河猴Clec9A基因编码区,亚克隆至pGEM-T载体,获得pGEM-T-DNGR质粒并进行测序。构建CLEC9A分子的CTLD区原核表达质粒pET-32a-CTLD,转化BL21(DE3),IPTG诱导重组蛋白表达,并用SDS-PAGE和Western blot法对目的蛋白进行鉴定。结果 PCR扩增得到726 bp的Clec9A编码区全长,测序和序列比对发现恒河猴CLEC9A编码区的核苷酸序列与人和小鼠的同源性分别为95.0%和73.1%,推测的氨基酸同源性分别为91.7%和57.3%。体外表达获得相对分子质量(Mr)约32 000的CTLD融合蛋白,Western blot方法鉴定发现其与人DNGR-1分子具有相似的抗原性。结论中国恒河猴Clec9A基因与人的高度相似并能编码与人CTLD抗原性相似的蛋白。     

1980-2010年广州市狂犬病监测分析

目的分析广州市1980-2010年30年间狂犬病的流行病学特征。方法收集狂犬病疫情资料及狂犬病病例个案调查表,用回顾性调查方法分析资料;采集疫区犬脑组织,用免疫荧光法和RT？PCR法检测狂犬病病毒抗原。结果 1980-2010年广州市共报告655例人间狂犬病,其中597例为1980-1989年报告的病例,占总病例数的91.15%,45例为2005-2010年报告的病例,占总病例数的6.87%,形成了2次流行高峰;45例患者中男性多于女性,10～55岁年龄组发病人数较多,学生、民工和农民居多。在疫区共捕捉86只犬,取脑组织,经免疫荧光和PCR检测,全部为阴性。结论广州市过去30年人间狂犬病有2次流行高峰;1990年以前犬免疫率低,人暴露后疫苗接种率低使人狂犬病发病率达到最高峰;2005年后,养犬数增多,人们预防狂犬病的意识放松,忽视伤口处理及暴露后免疫,导致狂犬病发病率回升;86只犬中未检测到狂犬病病毒,说明广州地区狂犬病病毒在家养犬中的流行强度较低。     

盐城市狂犬病毒核蛋白及糖蛋白基因序列分析

目的对江苏省盐城市狂犬病毒核蛋白及糖蛋白的基因进行遗传学分析,揭示流行于该地区的狂犬病毒与人用及兽用狂犬病疫苗株间的差异。方法以直接免疫荧光法检测犬脑标本,用阳性犬脑组织悬液接种鼠脑分离病毒。以RT-PCR法扩增病毒核蛋白及糖蛋白全基因片段,克隆测序后进行遗传学分析。结果从58份犬脑中发现两份样品狂犬病毒抗原阳性,分别命名为Jiangsu Yc87与Jiangsu Yc88。从两份阳性样品均扩增到全N基因与G基因序列。阳性犬脑组织接种乳鼠后,从Jiangsu Yc88样品分离到狂犬病毒。分析发现两株病毒均为基因1型狂犬病毒,两株病毒间N基因与G基因的核苷酸及氨基酸的同源性分别为99.8%和99.7%,氨基酸的同源性分别为99.3%和98.8%。与已知的狂犬病毒相比,两株病毒与我国宁夏、河南、湖南、印度尼西亚病毒株的同源性较高,N基因的核苷酸及氨基酸同源性分别为86.3%～98.7%和95.4%～99.8%,G基因核苷酸及氨基酸同源性分别为82.1%～92.1%和94.1%～95.7%;Jiangsu Yc87与Jiangsu Yc88N基因的氨基酸序列分别发生了4和2处氨基酸的替换,G基因的氨基酸序列发生了29和26处氨基酸的替换。与当前使用的疫苗株相比,两株病毒与CTN疫苗株同源性较高,N基因与G基因核苷酸同源性分别为90.2%和87.1%～87.3%,氨基酸同源性分别为98.4%和91.7%～92.3%,但G基因膜外区与所有疫苗株无显著差异;N基因的氨基酸序列分别发生了5和6处氨基酸的替换,G基因的氨基酸序列发生了31和28处氨基酸的替换。结论两株狂犬病毒为基因1型狂犬病毒,其N基因和G基因的核苷酸序列以及推导出来的氨基酸序列与已知的1型狂犬病毒株及疫苗株均有一定的差异。     

中国恒河猴DNGR-1分子C型凝集素样结构域在大肠杆菌系统表达北大核心CSCD

目的获得恒河猴C型凝集素结构域家族9的A成员(Clec9A)基因编码区序列;体外表达CLEC9A的C型凝集素样结构域(CTLD)。方法利用Clec9A基因特异引物,反转录PCR扩增中国恒河猴Clec9A基因编码区,亚克隆至pGEM-T载体,获得pGEM-T-DNGR质粒并进行测序。构建CLEC9A分子的CTLD区原核表达质粒pET-32a-CTLD,转化BL21(DE3),IPTG诱导重组蛋白表达,并用SDS-PAGE和Western blot法对目的蛋白进行鉴定。结果 PCR扩增得到726 bp的Clec9A编码区全长,测序和序列比对发现恒河猴CLEC9A编码区的核苷酸序列与人和小鼠的同源性分别为95.0%和73.1%,推测的氨基酸同源性分别为91.7%和57.3%。体外表达获得相对分子质量(Mr)约32 000的CTLD融合蛋白,Western blot方法鉴定发现其与人DNGR-1分子具有相似的抗原性。结论中国恒河猴Clec9A基因与人的高度相似并能编码与人CTLD抗原性相似的蛋白。     

北海道型汉坦病毒核蛋白基因的克隆表达及其免疫原性

目的 构建北海道型汉坦病毒(HOKV)核蛋白(NP)基因的重组杆状病毒表达载体,在昆虫细胞中表达出具有免疫原性的抗原,用于HOKV的检测及诊断.方法 应用RT-PCR方法扩增HOKVFusong-Cr-247株的NP基因,并将该基因片段克隆到PCR[R]2.1TA载体,转化到One ShortTM TOP10感受态细胞构建TA克隆载体,并与pFastBacTM1转座质粒载体分别用Kpn I和Not I双酶切,用T4连接酶连接,构建pFast PUUV-S重组转座质粒,经双酶切、PCR扩增及插入序列方向鉴定后.转化到DH10BacTM E.coli 感受态细胞,经三抗培养基筛选和PCR扩增鉴定后获得重组Bacmid质粒,将重组Baemid质粒转染Sf9昆虫细胞制备重组杆状病毒毒液,并继续扩增重组杆状病毒,以第三代毒液感染Sf9昆虫细胞,96h后收获细胞.用间接免疫荧光(IFA)、SDS-PAGE和Western blot对表达产物进行鉴定和分析.结果 实验应用Bac-to-BacTM杆状病毒表达系统,成功构建了含普马拉类汉坦病毒核蛋白基因的重组杆状病毒表达载体.并在昆虫细胞中获得表达.IFA结果显示,感染细胞的胞浆中有亮绿色荧光颗粒,SDS-PAGE和Western blot检测细胞表达产物的50×103(M)的蛋白条带,证实重组病毒感染昆虫细胞后表达了相应的重组核蛋白,与预计的结果相符.并能与抗汉坦病毒抗体结合.结论 成功表达具有HOKV免疫原性及反应性的重组核蛋白,为研制HOKV的诊断试剂奠定了基础.     

MTT在测定食品中细菌总数的应用研究

食品中细菌总数是反映食品卫生的基本指标，因此，在原材料、加工、保藏、运输、消费等各个环节进行卫生质量控制时经常需要检测，目前除标准检测方法外还有改进的传统方法，在营养琼脂中添加TTC（氯化三苯四氮唑）就是应用最广泛的一种，尽管已证明该方法与标准方法检测结果存在一定差异，但细菌在该培养基上可生长成红色菌落，易于识别，许多实验室一直在使用。作者通过实验，以3-（4，5-二甲基噻唑-2）-2，5-二苯基四氮唑盐（简称MTT）替代TTC检测了50份各类食品，与标准方法进行了对比，分析了存在差异的原因，     

狂犬病毒核蛋白基因的克隆表达及其免疫原性

目的构建狂犬病毒核蛋白(NP)基因的重组杆状病毒表达载体,在昆虫细胞中表达出具有免疫原性的抗原,用于狂犬病的检测及诊断。方法应用RT-PCR方法扩增ERA株狂犬病毒NP基因后克隆到PCR2.1TA载体,转化OneShortTMTOP10感受态细胞构建TA克隆载体,并与pFastBacTM1转座质粒载体分别用KpnΙ和NotΙ双酶切,用T4连接酶连接,构建pFast ERA-NP重组转座质粒,经双酶切、PCR扩增及插入序列方向鉴定后,转化到DH10BacTME.coli感受态细胞,经三抗培养基筛选和PCR扩增鉴定后获得重组Bacmid质粒,将重组Bacmid质粒转染Sf9昆虫细胞制备重组杆状病毒毒液,并继续扩增重组杆状病毒,以第三代毒液感染Sf9昆虫细胞,96h收获细胞,用直接免疫荧光(DFA)、SDS-PAGE和Western blot对表达产物进行检测和分析。结果构建了含有ERA NP基因的重组杆状病毒,并在昆虫细胞中获得表达。结论本研究成功表达出了具有免疫原性的狂犬病毒核蛋白。     

人绒毛外滋养层细胞HTR-8/SVneo 中Toll样受体mRNA的表达及对吲哚胺2,3-双加氧酶mRNA水平的影响

目的系统检测人绒毛外滋养细胞HTR-8/SVneo中Toll样受体（TLR）mRNA的表达情况,定量分析TLRs配体刺激前后吲
哚胺2,3双加氧酶（indoleamine 2,3-dioxygenase, IDO）mRNA的表达差异。方法RT-PCR检测HTR-8/SVneo细胞中TLR 1-10
mRNA 的表达情况;实时荧光定量RT-PCR 检测TLR3、TLR4、TLR7/8、TLR9 配体刺激前后IDO mRNA 表达水平。结果
HTR-8/SVneo细胞中有IDO及TLR 1-10 mRNA表达;在48 h内IDO mRNA表达随着时间延长,呈升高趋势;IDO mRNA的表
达与培养基营养状况相关;TLRs配体刺激后,除TLR-3转录水平表达下调外,TLR-4、7、8、9 mRNA表达均上调;poly（I∶C）刺激
后IDO mRNA 表达低于正常组,IFN-γ刺激后表达高于正常组（P<0.05）。结论TLRs mRNA的表达提示该细胞具有抗感染作
用;HTR-8/Svneo细胞中IDO mRNA的表达与母胎界面营养状况相关;TLRs配体刺激剂对TLRs及IDO mRNA表达的影响不
仅验证了TLRs的功能活性,而且提示了IDO在抗病原体免疫应激中可依赖TLRs途径发挥作用。