斑马鱼mcm3合子基因敲除实验模型的构建与鉴定

目的 构建斑马鱼mcm3合子基因突变体,研究mcm3合子基因在斑马鱼胚胎早期发育中的作用.方法 利用系统发育树分析不同物种间mcm3基因的保守性;利用国家生物技术信息中心(NCBI)网站及Jalview软件序列比对,分析斑马鱼MCM3蛋白与人类MCM3蛋白之间的氨基酸同源性;用CRISPR/Cas9技术构建可稳定遗传的斑马鱼mcm3合子基因缺失突变体;提取胚胎的基因组DNA后进行基因测序,检测斑马鱼mcm3合子基因突变类型;利用原位杂交检测mcm3突变体中mcm3 mRNA的表达水平.结果 斑马鱼合子基因mcm3与人类mcm3基因同源,且高度保守;可稳定遗传的mcm3合子基因突变体成功构建;在mcm3突变体斑马鱼中,胚胎从第3天开始出现头和眼睛,其外部表型较野生型斑马鱼小,且mcm3纯合子胚胎在第8天后相继死亡;运用整胚原位杂交发现,mcm3在野生型斑马鱼的头部、眼睛、中后脑边缘、鳃、胸腺及内胚层组织中高表达,但在mcm3突变体斑马鱼中,mcm3 mRNA的表达水平明显降低.结论 斑马鱼mcm3基因缺失突变体成功构建,并且mcm3基因在斑马鱼的早期胚胎发育中起重要作用.     

斑马鱼sh3d19基因的结构和表达分析

目的 探索斑马鱼sh3d19基因生物信息学分析和基因表达模式。方法 利用生物信息学方法对斑马鱼sh3d19的基因结构和物种间进化等进行分析,并运用逆转录PCR技术和胚胎原位杂交技术分析斑马鱼sh3d19在胚胎早期发育中的表达。结果 斑马鱼sh3d19位于1号染色体（ZDB-GENE-050522-481）上,全长85994bp,能编码958个氨基酸,斑马鱼Sh3d19蛋白与其他物种的Sh3d19同源物具有较高保守性。逆转录PCR结果显示,斑马鱼sh3d19在胚胎发育的各个时期表达,但在bud时期表达量较低。原位杂交结果显示,sh3d19在4细胞到3.5h在胚胎所有细胞中广泛表达,在bud时期虽然表达但是表达量较低,在18体节时期该基因在体节中丰富表达,在24h时与非成熟的肌节表达。结论 sh3d19在胚胎发育早期各个时期均表达,但在体节发生时期在体节中丰富表达,该研究结果为今后探究sh3d19基因在组织器官发育中的功能及机制奠定基础。     

斑马鱼丝氨酸羟甲基转移酶1基因的生物信息学和表达分析

目的 探索斑马鱼丝氨酸羟甲基转移酶1(shmt1)基因的生物学结构和基因表达模式.方法 利用生物信息学方法对斑马鱼shmt1的基因结构、物种间同源性、物种间进化、蛋白质二级结构和三级结构等进行分析和预测,并用整胚原位杂交技术探究斑马鱼shmt1在重要器官及胚胎早期发育中的表达.结果 斑马鱼shmt1位于3号染色体(ZDB-GENE-040426-1558)上,全长15142 bp,能编码481个氨基酸,属于天冬氨酸转氨酶(AAT)超家族,其二级结构以α-螺旋和无规则卷曲为主,且斑马鱼shmt1蛋白与其他哺乳动物同源物在进化上高度保守.反转录定量PCR(RT-PCR)结果显示,斑马鱼shmt1不仅在胚胎发育的各个时期表达,而且也在成年鱼的肾脏、心脏和性腺中高表达.原位杂交结果显示,shmt1除了在卵黄多核层、鼻翼板中脑区、视顶盖和视泡等处集中表达,还在肝脏特异性表达.结论 shmt1作为一碳代谢叶酸循环中的重要蛋白,在斑马鱼发育早期的胚胎卵黄多核层、鼻翼板中脑区、视顶盖和视泡、肝脏特异性表达.该研究为今后以斑马鱼为模型动物探究shmt1基因在器官发育中的功能研究奠定基础.