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目的构建pEGFP-N3-TFPI-2真核表达载体,为研究TFPI-2基因的功能做准备。方法从胎盘组织中提取总RNA,逆转录合成cDNA,再以PCR法进行扩增。将扩增的TFPI-2基因片段克隆到pEGFP-N3真核表达载体上,经XhoI和KpnI双酶切后,行1%琼脂糖凝胶电泳鉴定,同时测定其DNA序列。将pEGFP-N3-TFPI-2真核表达载体以脂质体LipofectamineTM2000介导的方法转染Top10感受态细胞(转染组),同时设空白对照组(仅转染pEGFP-N3质粒)和未转染组(不予转染)。采用Westernblot法检测3组细胞中TFPI-2蛋白的表达情况。结果总RNA经分光光度法验证,其纯度符合PCR法扩增的要求。构建的pEGFP-N3-TFPI-2真核表达载体经XhoI和KpnI双酶切后,行1%琼脂糖凝胶电泳,结果显示,分别在708bp处和4700bp处有特异扩增条带,大小与理论值一致。DNA序列测定结果证实,pEFFP-N3-TFPI-2真核表达载体的序列完全正确。Westernblot法结果显示,TFPI-2蛋白的表达量转染组为0.6573±0.0325,空白对照组为0.3017±0.0287,未转染组为0.3143±0.0266,转染组TFPI-2蛋白的表达量高于空白对照组和未转染组,差异有统计学意义(P〈0.01)。结论本实验成功构建了pEGFP-N3-TFPI-2真核表达载体,为TFPI-2基因功能的研究奠定了基础。 相似文献
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目的:研究5-氮杂-2′-脱氧胞苷(5-Aza-CdR)对胃癌SGC7901细胞增殖的抑制作用。方法:取SGC7901对数生长期细胞,分别加入0(未给药)、0.1、0.5、1.0、5.0μmol/L5-Aza-CdR,每个浓度设3个复孔,分别于给药后24、48、60、72h,采用MTT法检测细胞增殖情况,采用蛋白质印迹法和逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)法分别检测细胞内组织因子途径抑制物2(TFPI-2)蛋白和mRNA的表达情况。结果:与未给药比较,除作用24h外,各浓度5-Aza-CdR作用48、60、72h后SGC7901细胞的增殖活性均明显降低,细胞内TFPI-2蛋白和mRNA表达均明显增加(P<0.05),且与浓度和时间呈正相关。结论:5-Aza-CdR可上调SGC7901细胞中TFPI-2基因的表达,对SGC7901细胞增殖具有抑制作用。 相似文献
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