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1.
构建携带胸苷激酶(tk)与增强型绿色荧光蛋白(EGFP)融合基因穿梭质粒,并观察其在肝癌细胞系HepG2细胞中的表达。应用基因重组技术,构建EGFP与tk的融合表达穿梭质粒载体,经限制酶切鉴定和测序分析,脂质体转染将其导入HepG2中,48h后用荧光显微镜观察荧光的表达,RT-PCR法检测融合蛋白tk和EGFP的mRNA表达,四甲基偶氮唑蓝(MTT)实验检测转染融合蛋白载体后不同浓度的更昔洛韦(GCV)对HepG2细胞的细胞毒作用。酶切鉴定和测序分析证实重组质粒中插入融合目的基因片断及载体DNA大小、方向和插入位点正确,在转染此穿梭质粒的HepG2细胞中检测到绿色荧光蛋白的表达,RT-PCR检测到融合蛋白tk和EGFP的mRNA表达;GCV对转染了携带tk与EGFP融合基因穿梭质粒载体有明显的细胞毒作用。成功构建携带tk与EGFP融合基因穿梭质粒载体,转染人肝癌细胞株HepG2中tk和EGFP的独立表达没有受到影响,该载体可利用绿色荧光蛋白作为报告基因监测tk的表达并可用于肝癌的自杀基因治疗。 相似文献
2.
目的:构建稳定表达乙型肝炎病毒X蛋白(HBx)的肝癌细胞株HepG2-HBx,探讨HBx对胰岛素样生长因子 II(IGF-II)基因P4启动子甲基化水平及转录表达的影响。方法:应用基因重组技术,构建含HBx基因的重组逆转录病毒载体pBABE-puro-HBx,采用磷酸钙共沉淀法将其转染293FT包装细胞产生逆转录病毒,感染HepG2肝癌细胞,采用嘌呤霉素进行阳性克隆筛选,Western blotting鉴定表达HBx蛋白的肝癌细胞株HepG2-HBx。采用亚硫酸氢盐测序法及实时荧光定量RT-PCR检测HepG2-HBx细胞中P4启动子甲基化水平及P4 mRNA表达水平变化。进一步将体外甲基化的人IGF-II基因P4启动子驱动的荧光素酶报告载体pGL3-P4及含HBx基因的pCMV-tag2B-X质粒共转染HepG2肝癌细胞,采用亚硫酸氢盐测序法及双萤光素酶实验检测pGL3-P4载体上P4启动子甲基化水平及转录调控活性变化。结果:(1)经Western blotting鉴定,成功构建了稳定表达HBx蛋白的肝癌细胞株HepG2-HBx;(2)表达HBx蛋白的HepG2-HBx细胞中P4启动子甲基化CpG位点的比例(9.0%)明显低于对照细胞HepG2-control(25.0%)(P<0.01),而其P4 mRNA表达水平则为对照细胞HepG2-control的2.8倍;(3)共转染pCMV-tag2B-X质粒的HepG2细胞中pGL3-P4载体上P4启动子甲基化CpG位点的比例(60.8%)明显低于共转染对照质粒pCMV-tag2B的HepG2细胞(84.1%)(P<0.01),而前者P4启动子相对萤光素酶活性(14.12±0.89)则明显高于后者(4.61±0.76)(P<0.01)。结论:HBx蛋白可降低IGF-II基因P4启动子甲基化水平,进而上调其转录表达。 相似文献
3.
4.
目的:构建人胰岛素样生长因子Ⅱ基因(IGF-Ⅱ)P3启动子驱动单纯疱疹病毒胸苷激酶(tk)与增强型绿色荧光蛋白(EGFP)融合基因穿梭质粒,观察其在肝癌细胞系HepG2及宫颈癌细胞系HeLa细胞中的表达及其作用。方法:应用基因重组技术,构建IGF-Ⅱ P3启动子驱动EGFP与tk融合表达穿梭质粒载体,脂质体转染技术将其转入HepG2及HeLa中,48 h后荧光显微镜下观察荧光表达,RT-PCR法检测tk和EGFP mRNA表达,四甲基偶氮唑蓝(MTT)实验检测转染融合蛋白载体后给予不同浓度的GCV对HepG2及HeLa细胞毒作用。结果:酶切鉴定和测序分析证实重组质粒构建成功;转染此穿梭质粒的细胞中仅有HepG2细胞检测到绿色荧光;RT-PCR检测到tk和EGFP的mRNA仅在HepG2细胞中表达;GCV对转染了携此质粒载体的HepG2细胞有选择性细胞毒作用。结论:成功构建IGF-Ⅱ P3启动子驱动携带tk与EGFP融合基因穿梭质粒载体,转染后对人肝癌细胞系HepG2有选择性杀伤作用,为进一步靶向性肝癌腺病毒基因治疗奠定了基础。 相似文献
6.
人胰岛素样生长因子Ⅱ(IGF-Ⅱ)是一种重要的胎儿生长因子,其基因含4个不同的启动子(P1~P4)。在生长发育过程中,4个启动子不同的生物活性,具有组织特异性和发育阶段独立性表达特征,P2~P4为胚胎型启动子,P1为成人型启动子。在胎肝和新生儿肝中IGF-Ⅱ mRNA表达量最高,其中P3活性最大,其次分别为P4及P2,P1失活,在成人肝脏中IGF-Ⅱ mRNA表达量显著下调,约为新生儿峰值的1/10,其中P1活性最大,依次为P4、P2及P3,约70%成人肝脏P3呈关闭状态,仅30%成人呈微量表达。近年研究发现,IGF-Ⅱ在模型动物肝脏和人类肝脏的癌前病变及肝癌组织中呈过量表达,但不同学者报道的IGF-Ⅱ异常表达量及阳性率差异较大,且多数为IGF-Ⅱ蛋白水平的定性研究。我们分析了乙型肝炎病毒(HBV)阳性肝癌的P1~P4调控的IGF-Ⅱ转录子表达水平的变化及其与临床病理特征的关系,旨在阐明IGF-Ⅱ基因启动子在肝癌癌变中的作用及其临床意义。 相似文献
7.
目的:设计并筛选高效沉默胰岛素样生长因子II(IGF-II)基因的小干扰RNA(siRNA)序列,构建由重组人甲胎蛋白(hAFP)和人端粒酶逆转录酶(hTERT)双启动子调控的该siRNA表达载体,观察其对肝癌细胞生长的影响。方法:根据siRNA设计原则,参照IGF-II mRNA序列设计3对siRNA序列及1对阴性对照序列,转染人肝癌Huh7细胞,转染24 h后采用实时荧光定量PCR检测IGF-II mRNA表达量变化,筛选干扰效率最高的siRNA序列。采用PCR扩增出hAFP及hTERT启动子的核心序列,应用基因重组技术构建重组hAFP和hTERT双启动子调控的该siRNA表达载体。将上述siRNA表达载体转染Huh7细胞及L-02人正常肝细胞,观察IGF-II mRNA表达及细胞生长情况变化。结果:实时荧光定量PCR显示,siRNA3在25 nmol/L浓度时抑制效率最高,约90%。成功扩增hAFP及hTERT启动子核心序列,将其分别克隆入pGL3-Basic载体,构建成重组pGL3-hAFP-hTERT载体;将siRNA3克隆至pGL3-hAFP-hTERT载体,构建成重组pGL3-hAFP-hTERT-siRNA3表达载体。Huh7细胞IGF-II mRNA表达量显著降低,抑制效率达86%,细胞增殖受到明显抑制,G1期细胞比例显著增加;L-02细胞上述指标无明显改变。结论: 成功构建双重RNA聚合酶II启动子(hAFP及hTERT双启动子)调控的针对IGF-II基因的siRNA表达载体,即pGL3-hAFP-hTERT-siRNA3;该siRNA表达载体可特异性抑制IGF-II mRNA表达及肝癌细胞生长。 相似文献
8.
席汉氏综合征(Sheehan's syndrome)是因产后大出血休克造成脑垂体前叶功能减退的一种内分泌疾病.该病起病隐匿,病程漫长,涉及多个系统,可出现恶心、呕吐、电解质紊乱等多种临床表现.可因各种应激如感染、手术、外伤及使用镇静剂、安眠药、降糖药导致诱发休克、昏迷等垂体危象.当席汉氏综合征合并肝硬化、慢性胃炎、贫血等疾病时易造成漏诊及误诊. 相似文献
10.
目的:观察腺病毒介导IGF - ⅡP3 启动子调控胸苷激酶对裸鼠肝癌移植瘤杀伤效应及毒性反应。方法:皮下接种HepG2 建立裸鼠肝癌移植瘤模型,瘤内注射重组腺病毒,第2 天腹腔注射GCV ,每4 天测量肿瘤体积大小,描绘肿瘤生长曲线,实验结束后处死裸鼠剥离肿瘤测量体积大小,RT-PCR 方法检测肿瘤及心、肝、肾脏组织中胸苷激酶表达,常规病理学检查观察心、肝和肾脏毒性反应。结果:Ad-tkEGFP-P 3 +GCV 治疗组裸鼠,其肿瘤生长显示被明显抑制,至第22天始,其体积明显小于其他各组(P<0.05);实验结束后剥离出的肿瘤,Ad-tkEGFP-P 3 +GCV 组肿瘤体积明显小于其他组;只在肿瘤组织中可见有胸苷激酶特异性表达,心、肝和肾脏中未见表达;常规HE染色病理检查,显示三种重要器官结构正常,未见有炎症、变性、坏死和细胞凋亡等现象。结论:腺病毒介导IGF-ⅡP3 启动子调控胸苷激酶可以抑制裸鼠肝癌移植瘤的生长,并对裸鼠无明显毒性反应,具有肝癌靶向基因治疗的可行性。 相似文献