毛细胞PMCA2在小鼠内耳Ca2+调节和听觉平衡中的作用

目的： 研究小鼠内耳毛细胞细胞膜Ca²⁺-ATP酶2型蛋白（PMCA2）在听觉平衡生理中的作用及意义。 方法：利用不同基因型小鼠PMCA2^-/-(突变纯合子)、PMCA2^+/-(杂合子)和PMCA2^+/+(野生型)为实验对象，采用听觉脑干反应(ABR)、畸变产物耳声发射(DPOAE)和耳蜗内电位(EP)检测等方法，分别检测不同基因型小鼠的内耳生理功能。结果：PMCA2^+/+野生型鼠的听力正常，ABR的短声(click)阈值为(13.75±11.08)dB SPL；EP均值为(91.3±11.0)mV。PMCA2^+/-杂合子小鼠听力低于同窝PMCA2^+/+野生型鼠，ABR的短声阈值为(63.89±12.90)dB SPL，与PMCA2^+/+小鼠比较差异显著(P<0.01)；PMCA2^+/-小鼠没有检测出DPOAE的高频区辐值，其EP均值为(80.7±9.0)mV。PMCA2^-/-小鼠的ABR在100 dB SPL无反应，表现出全聋和平衡功能失调，其EP均值为(56.6±13.0)mV；PMCA2^-/-小鼠没有检测出DPOAEs。结论：PMCA2是内耳毛细胞纤毛丛上的重要Ca²⁺转运通道，对维持内耳的Ca²⁺代谢和听觉平衡功能有重要作用。     

离子转运蛋白抑制-听觉实验研究NKCC1和Na,K-ATPase在耳蜗K+循环中的作用

目的通过离子转运蛋白抑制-听觉功能实验,探讨NKCC1和Na,K-ATPase在内耳K 循环及听觉中的作用,并验证耳蜗K 循环模式与听觉的关系。方法应用NKCC1抑制剂呋塞米(Furosemide)和Na,K-ATPase抑制剂乌巴因(Ouabain),对CBA/CaJ和Castel两种鼠系进行离子转运蛋白抑制-听觉实验,检测小鼠的听觉脑干反应(ABR)阈值。结果Furosemide 0.2 mg/g注射30 min后,小鼠的ABR阈值明显升高,与正常对照组比较差异有极显著性意义(P<0.01)。Ouabain 0.003μg/(g.d)连续注射5 d后,小鼠的ABR阈值也明显升高,与对照组相比较差异有极显著性意义(P<0.01)。而先后注射Ouabain和Furosemide,ABR阈值虽较正常对照组升高(P<0.05),但低于单独注射Ouabain组(P<0.05)和明显低于单独注射Furosemide组(P<0.01)。停药3 d后,小鼠的ABR阈值均恢复到接近正常对照组的阈值(均P>0.05)。结论在小鼠实体中验证了NKCC1和Na,K-ATPase是耳蜗K 循环的关键离子转运蛋白,其中任一功能失衡均可影响听觉功能。     

ABR和DPOAE检测研究NKCC1在不同基因型小鼠耳蜗听觉中的作用

目的 应用听性脑干反应(ABR)和畸变产物耳声发射(DPOAE)技术检测不同基因型NKCC1小鼠的听觉功能,研究NKCC1在耳蜗听觉功能中的作用.方法 利用ABR和DPOAE实验检测不同基因型NKCC1小鼠的听觉功能.结果 NKCC1 / 野生型小鼠听力正常,ABR检测的短声(click)阈值为(23.13±3.78) dB SPL;NKCC1 /-杂合子小鼠听力低于NKCC1 / 野生型小鼠,其短声阈值为(38.49±12.29) dB SPL.NKCC1 / 和NKCC1 /-小鼠ABR的阈值均值在各个频率的差异有极显著性意义(均P<0.01);NKCC1-/-突变纯合子鼠的ABR的各个频率在100 dB均无反应,呈现全聋.与NKCC1 / 小鼠比较,NKCC1-/-小鼠没有DPOAE的检出.结论 耳蜗NKCC1在小鼠的听觉生理中有重要作用,NKCC1缺失或是功能受限均可影响耳蜗的听觉功能.     

L型电压门控钙通道α1D亚基在内耳毛细胞的分布及在听力中的作用

目的探讨L型电压门控钙通道α1D亚基在内耳毛细胞的分布及在听力中的作用。方法应用免疫细胞化学荧光标记观察L型电压门控钙通道α1D亚基在牛蛙毛细胞上的分布;利用听性脑干反应(ABR)检测携带不同L型电压门控钙通道α1D基因型(α1D / 、α1D /-和α1D-/-)小鼠的听力。结果L型电压门控钙通道α1D亚基主要密集分布于毛细胞侧膜和顶膜,在毛细胞的胞核区域和纤毛丛处没有阳性荧光染色。三种α1D基因型小鼠的ABR检测结果显示,α1D / 野生型小鼠的短声反应阈正常,为34.8±5.7dBSPL;α1D /-杂合子小鼠反应阈高于同窝生α1D / 野生型小鼠,为54.4±12.4dBSPL;α1D-/-小鼠呈现全聋,ABR在100dBSPL时仍无反应。结论L型电压门控钙通道的α1D亚基分布在牛蛙毛细胞的侧膜和顶膜,在内耳的听觉生理中具有重要作用。L型电压门控钙通道α1D亚基缺失或是数量的减少均可以影响小鼠听力。     

自制小鼠显微手术拉钩

目的 介绍一种显微手术用磁力底座拉钩及其在小鼠显微微创手术中的应用.方法 磁力底座拉钩由纽扣磁铁、螺栓、螺母及牙用不锈钢丝弯折而成的拉钩组成.螺栓倒扣在磁铁上组成简易的磁力底座;不锈钢丝拉钩经两个螺母夹持固定在磁力底座的螺栓上,组成简易的磁力底座拉钩;纽扣磁铁具有较强的磁性,可使磁力底座拉钩吸附在不锈钢手术平台上.利用该拉钩辅助小鼠听泡暴露手术,并与传统常规拉钩进行比较.结果 磁力底座拉钩可方便并有效牵引手术切口及肌肉等软组织,牵引方向、高度及强度均可调节,可获得良好的术窗暴露效果;与常规拉钩相比,可明显缩短手术切口,对肌肉及血管损伤少,减少意外出血机会.结论 磁力底座拉钩可方便有效地暴露小鼠听泡显微手术窗口,具有微创特点,可作为一种简单有效且易于推广的小鼠显微手术器械.     

PMCA1-4及其A端和C端剪接变异体在成年大鼠前庭组织中的表达

目的 研究质膜钙ATP酶异构体1-4(plasma membrane Ca²⁺-ATPase 1-4,PMCA1-4)在成年大鼠前庭组织的分布部位,及其A端和C端剪接变异体的表达类型。方法 选择8周龄健康SD大鼠,解剖出内耳器官行前庭切片,同时取前庭椭圆囊斑和球囊斑提取总RNA。通过免疫荧光方法检测PMCA1-4在成年大鼠内耳前庭组织的表达部位,通过逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)法检测PMCA1-4的A端和C端剪接变异体在成年大鼠前庭组织的表达类型。结果 球囊和椭圆囊荧光染色切片中,于毛细胞和支持细胞的胞体外侧膜可见PMCA1表达,毛细胞纤毛中可见PMCA2强表达,毛细胞和支持细胞的胞体外侧膜可见PMCA3弱表达,PMCA4几乎不表达。4种PMCA亚型在球囊表达的剪接体分别为PMCA1x/b、PMCA2w/b、PMCA3z/(a, b)和PMCA4x/b,它们在椭圆囊的表达类型与球囊相同。结论 PMCA1-4在成年大鼠前庭器官的表达部位存在差异,这4种PMCA亚型的剪接体类型也各不相同。这种差异性可能是为了满足前庭组织和亚细胞结构域对Ca²⁺     

3例累及邻近多部位的儿童鼻腔鼻窦胚胎型横纹肌肉瘤临床分析

目的探讨儿童横纹肌肉瘤（rhabdomyosarcoma,RMS）的临床特点、影像学检查及临床病理学特征,以期减少漏诊误诊,提高临床诊断和鉴别诊断水平。方法回顾性分析3例不典型学龄前期儿童RMS的详细临床资料并复习相关文献。结果2例以眼部症状为主诉收入院,1例罕见以反复鼻腔出血并睡觉打鼾为主诉收入院,相关影像学检查显示肿瘤多已广泛侵犯破坏周围结构,行相关手术病理确诊,均为胚胎性RMS。免疫组化显示3例患者Myogenin均为阳性,Ki 67（LIt分别约为90%、80%、70%）,其中2例VIM阳性,2例DES（部分或者局灶性）阳性,2例CD99阳性。后转入肿瘤科规律治疗。结论儿童RMS早期临床表现不典型呈现多样化,具有恶性程度高、侵袭性强、进展快等特点,需要根据临床特征结合影像学检查及免疫组化结果确诊。     

小鼠内耳显微解剖技术照明方法的改进

目的介绍连续变倍体视显微镜(Zoom-stereo microscope)的一种特殊的暗视野照明方法在内耳显微解剖中的应用。方法在小鼠耳蜗解剖中,采用纤维导光束(也称万向冷光源)从玻璃平皿侧面照射(侧射式),使光线从侧面进入,经标本反射后进入连续变倍体视显微镜光学系统而成像;并与常规的两种照明方法(落射式和透射式)的效果进行比较。结果侧射式照明效果明显比落射式和透射式好,其背景光线的干扰显著降低,达到暗视野成像效果。结论采用侧射式照明,可以提高内耳显微解剖技术的水平。     

耳蜗血管纹钾钠氯化合物协同转运子对年龄相关性听力下降的影响

目的 观察具有年龄相关性听力下降（age-related hearing loss，AHL）特点的不同周龄C57BL／6J鼠和钾钠氯化合物协同联合转运子-1（Na-K-2Cl cotransporter-1，NKCC1）基因敲除鼠年龄相关性听力改变与耳蜗血管纹NKCC1表达的情况，并检测不同龄的NKCC1^＋/-杂合子小鼠耳蜗NKCC1蛋白表达及耳蜗扫描电镜形态变化，研究血管纹NKCC1在老年性聋发病中的作用。方法 应用听性脑于反应（ABR）分别检测4、8、16、32、48、60周龄组C57BL／6J小鼠和两种基因型NKCC1小鼠的听力，采用免疫组化法观察其血管纹NKCC1表达的变化，同时采用免疫印迹杂交（Western Blot）检测不同周龄小鼠耳蜗的NKCC1蛋白的含量，扫描电镜观察不同周龄小鼠的耳蜗基底膜结构。结果 C57BL／6J小鼠随鼠龄增加而出现听力下降，自16周龄时ABR阈值出现显著性增高（P〈0．05）；血管纹NKCC1蛋白表达也呈现随鼠龄增加而逐步减低，其灰度值自16周龄时显著增高（P〈0．01）。NKCC1^＋/-杂合子鼠的听力随鼠龄增长而逐渐下降，老龄小鼠的ABR阈值与其低龄时相比，阈值显著性升高（P〈0．05）。老龄小鼠的耳蜗NKCC1蛋白含量低于低龄小鼠，老龄NKCC1^＋／-小鼠的耳蜗底回外毛细胞（OHC）出现散在性点状缺失。结论 AHL小鼠血管纹NKCC1蛋白表达随年龄增长而减少，显示与AHL相关，老年性聋的发病可能与血管纹NKCC1通道蛋白的遗传特性及功能有关。     

大鼠嗅球嗅鞘细胞的改良培养及耳蜗内植入的初步研究

目的 建立并改良大鼠嗅球嗅鞘细胞(olfactory ensheathing cells,OECs)的取材、纯化、培养、鉴定及示踪方法,并初步探讨OECs耳蜗内植入的可行性.方法 采用改良法分离新生3 d的SD大鼠嗅球OECs,用差速贴壁加抗有丝分裂法行纯化培养,观察培养细胞的形态特点及生长情况,利用低亲和力神经生长因子受体NGFRp75行免疫组化鉴定并评估细胞纯度.将纯化培养7 d后的OECs与5-溴-2′-脱氧尿嘧啶核苷(5-bromo-2′-deoxyuridine,BrdU)共同孵育48 h,以免疫荧光法观察OECs的增殖活性;同法标记供移植用的OECs.在成年大鼠耳蜗底周钻微孔,注入OECs悬液,24 h后作耳蜗冰冻切片行免疫荧光染色,观察移植的OECs在蜗内存活与分布情况.结果 用改良技术体外培养的OECs增殖速度快,于第9天细胞数量最多,且逐渐表现出典型的形态学特征;绝大部分培养的OECs NGFRp75免疫组化呈阳性反应,细胞纯度最高达85%.OECs与BrdU共同孵育48 h后,约90%的培养细胞免疫荧光呈阳性反应.初步建立了内耳OECs移植方法;经耳蜗底周注入OECs后24 h,BrdU阳性细胞主要分布于耳蜗的外淋巴腔,部分细胞附着于鼓阶外侧壁.结论 采用改良的嗅球OECs分离培养法可以获得高纯度、增殖活性良好的OECs;OECs耳蜗内植入后短期内可存活,初步提示耳蜗内OECs移植基本可行,值得进一步研究.