肝星状细胞诱导卵圆细胞向成熟肝细胞分化的体外研究

目的 研究肝星状细胞(HSC)在体外培养的卵圆细胞向成熟肝细胞分化过程中所起的作用.方法 (1)将卵圆细胞分别与原代培养的HSC混合共培养(混合共培养组),采用Millicell小室不接触共培养(不接触共培养组),卵圆细胞单独培养作为对照组.在共培养后第7、14、21天观测,采用Western blot和荧光定量PCR检测肝细胞核因子4 α(HNF-4 α)、白蛋白和甲胎蛋白(AFP)、细胞角蛋白19(CK-19)的表达量;(2)电子透射显微镜观察卵圆细胞超微结构的变化;(3)过碘酸希夫染色检测各时间点卵圆细胞内糖原颗粒的含量;(4)酶联免疫吸附法检测各时间点卵圆细胞分泌白蛋白的含量.统计学处理采用重复测量资料的多因素方差分析和LSD-t检验.结果 (1)卵圆细胞第7、14、21天表达HNF-4 α和白蛋白的mRNA的量(相对与共培养之前的表达量的倍数):混合共培养组HNF-4 α分别为(1.9±0.2)倍、(10.7±1.2)倍、(12.0±1.3)倍;白蛋白mRNA的量分别为(5.7±1.6)倍、(110.7±13.7)倍、(173.6±22.3)倍;不接触共培养组HNF-4 α分别为(1.4±0.1)倍、(3.2±0.6)倍、(8.9±1.4)倍;白蛋白mRNA的量分别为(2.9±1.4)倍、(22.3±8.5)倍、(96.3±16.3)倍.共培养组(混合共培养与不接触共培养组)的表达量均高于对照组,LSD-t值分别为32.98,10.08;13.38,7.96; P值均<0.01,差异有统计学意义.第7、14、21天AFP、CK-19的表达量:混合共培养组AFP分别为(1.1±0.2)倍、(0.2±0.0)倍、(0.0±0.0)倍;CK-19分别为(0.2±0.1)倍、(0.0±0.0)倍、(0.0±0.0)倍;不接触共培养组AFP分别为(1.0±0.2)倍、(0.2±0.1)倍、(0.1±0.0)倍;CK-19分别为(0.6±0.1)倍、(0.1±0.0)倍,(0.0±0.0)倍.共培养组(混合共培养与不接触共培养组)的表达量均低于对照组.LSD-t值分别为37.99,34.50;13.59,22.46;P值均<0.01,差异有统计学意义.(2)卵圆细胞共培养后白蛋白分泌量明显增加:混合共培养组:14 d为(15.30±0.09)ng/ml、21 d(20.98±0.12)ng/ml,不接触共培养组14 d为(11.41±0.13)ng/ml,21 d为(15.12±0.17)ng/ml,混合共培养组高于不接触共培养组,LSD-t=251.94,P<0.01,差异有统计学意义.(3)随着共培养时间的延长,卵圆细胞内质网、线粒体和高尔基体等细胞器逐渐丰富,且细胞间形成毛细胆管结构.(4)过碘酸希夫染色显示共培养后卵圆细胞内出现大量红色糖原颗粒.结论 HSC可以诱导卵圆细胞向成熟肝细胞分化,HSC除了通过细胞因子等可溶性因子途径发挥作用外,与卵圆细胞的直接接触也有着重要作用.     

来华MBBS留学生物理诊断实践课教学探讨与思考

全英文教学的本科临床医学专业(bachelor of medicine and bachelor of surgery,MBBS)留学生物理诊断学实践课带教中存在缺乏统一教材、语言交流障碍、文化背景差异、纪律性较差等问题.带教教师需努力提高自身语言和专业水平,加强对留学生的管理和交流.针对MBBS留学生的特点可采用多元教学模式和考核评估系统,努力提高留学生的教学质量.     

肾小管上皮细胞转分化中CIP4与β连环素的相互作用

目的 探讨在大鼠肾脏纤维化组织中CIP4(Cdc42-interacting protein 4)的表达和分布,以及在转化生长因子β1(TGF-β1)诱导的人肾小管上皮细胞(HK-2)-间质细胞转分化(EMT)模型中,CIP4与β连环素(β-catenin)之间的相互作用关系.方法 体内实验用SD大鼠5/6肾切除法建立肾纤维化模型,根据Masson染色结果观察肾脏组织纤维化程度;用免疫组织化学染色观察CIP4在模型组和假手术组的表达和分布.体外实验用HK-2细胞株作为研究对象,使用TGF-β1(10 μg/L)刺激72 h建立EMT模型.Western印迹法检测E钙黏蛋白(E-cadherin)和α平滑肌肌动蛋白(α-SMA)蛋白表达变化,同时检测CIP4和β-catenin的表达水平;免疫荧光法观察CIP4和β-catenin在两组细胞中的共定位关系;免疫共沉淀方法检测CIP4和3-catenin之间的相互作用关系;用脂质体2000将质粒pcDNA4.0-CIP4瞬时转染至HK-2细胞,Western印迹法检测高表达CIP4对上述指标的影响,以及高表达CIP4与TGF-β1刺激对β-catenin入核的影响.结果 体内实验,CIP4在假手术组和5/6肾切除组大鼠肾组织中都有表达,在纤维化的肾脏组织中表达上调,主要分布在肾小管中,且在上皮细胞侧基底膜处聚集.体外实验,与对照组相比,EMT模型组HK-2细胞CIP4和α-SMA蛋白表达明显增高,分别是对照组的1.8倍和2.5倍,同时E-cadherin表达量减少(均P＜0.05),β-catenin表达量无明显变化.免疫荧光结果显示对照组CIP4与β-catenin主要分布于细胞膜,且在细胞膜上存在部分共定位;模型组中,CIP4与β-catenin在细胞膜上分布减少,细胞核内表达增多,细胞核内存在部分共定位现象.免疫共沉淀结果表明在以上两组细胞中,CIP4和β-catenin均存在相互作用.单独转染CIP4目的基因质粒的HK-2细胞中,CIP4与α-SMA表达上调,分别为对照组的3.5倍与1.7倍,并伴有E-cadherin表达下降(均P＜0.05),与单独TGF-β1刺激相似;高表达CIP4与TGF-βl刺激均可上调β-catenin在核蛋白中的表达,分别为对照组的2.0倍和2.5倍(P＜0.05).结论 CIP4在5/6肾切除组大鼠肾脏组织中表达上调,且主要分布于肾小管上皮细胞侧基底膜处,其与β-catenin有部分共定位,且存在相互作用,提示CIP4可能通过促进β-catenin入核,参与EMT的进程.     

不同模式血液净化技术治疗肝功能衰竭的疗效观察

目的 探讨不同模式血液净化技术对肝功能衰竭患者疗效的评价.方法 选取华中科技大学同济医学院附属同济医院接受血液净化治疗的肝功能衰竭患者,包括血浆置换(plas-ma exchange,PE)、PE+胆红素吸附及PE+双重血浆分子吸附(double plasma molecular adsorp-tion system,...     

CIP4对转化生长因子β1诱导的人肾小管上皮细胞-间充质转分化的影响

目的 观察骨架调节蛋白CIP4（Cdc42 interacting protein 4）对转化生长因子β1（TGF-β1）诱导的人肾小管上皮细胞-间充质转分化（EMT）的影响,并探讨其产生的机制。 方法 10 ?滋g/L TGF-β1刺激72 h诱导人近端肾小管上皮细胞（HK-2细胞）向间充质转分化。Western印迹法检测各组细胞内E-cadherin和α-SMA蛋白的表达。倒置显微镜观察细胞形态的变化。根据GenBank人CIP4的完全cDNA序列,设计1条特异性干扰CIP4表达的RNA片段（CIP4-siRNA）和含野生型CIP4的重组真核表达质粒（pcDNA3.1-hCIP4）,利用lipofactamine 2000将其转染HK-2细胞。Western 印迹法检测对照组、TGF-β1刺激组、CIP4-siRNA转染组、pcDNA3.1-CIP4转染组细胞内CIP4、E-cadherin和α-SMA蛋白的表达,共聚焦显微镜观察 E-cadherin和α-SMA蛋白的分布改变;用PI3K-Akt特异性抑制剂渥曼青霉素（wortmannin） 1 μmol/L干预TGF-β1刺激的HK-2细胞48 h,Western 印迹法检测对照组和干预组CIP4表达的变化。 结果 TGF-β1干预后HK-2细胞E-cadherin蛋白表达显著减少（P ＜ 0.05）,α-SMA蛋白表达显著增多（P ＜ 0.05）,细胞形态由典型的上皮细胞向肌成纤维细胞转变,表明TGF-β1诱导肾小管上皮细胞EMT模型成功。CIP4-siRNA抑制TGF-β1诱导的HK-2细胞表达CIP4后,E-cadherin蛋白表达显著增多（P ＜ 0.05）,α-SMA蛋白表达显著减少（P ＜ 0.05）,部分逆转了上述TGF-β1诱导的肾小管上皮细胞EMT。pcDNA3.1-hCIP4转染使CIP4高表达后,HK-2细胞E-cadherin蛋白表达显著减少（P ＜ 0.05）,α-SMA蛋白表达显著增多（P ＜ 0.05）,诱导了肾小管上皮细胞EMT。用渥曼青霉素干预TGF-β1刺激的HK-2细胞48 h,CIP4可能蛋白表达显著减少（P ＜ 0.05）。 结论 TGF-β1通过PI3K-Akt途径上调CIP4表达,CIP4可能进一步参与TGF-β1诱导的肾小管上皮细胞EMT过程。     

CIP4在肾间质纤维化中的表达及作用

目的 观察骨架调节蛋白CIP4（Cdc42 interacting protein-4）在肾纤维化过程中表达水平、细胞内定位及高表达的CIP4基因对人肾小管上皮细胞E钙黏蛋白（E-cadherin）、波形蛋白（vimentin）的表达和β连环素（β-catenin）酪氨酸磷酸化水平的影响。 方法 体外实验以人近端肾小管上皮细胞（HK-2细胞）为研究对象,10 μg/L TGF-β1刺激72 h诱导HK-2细胞转分化; Western 印迹法检测各组细胞内CIP4、E-cadherin、vimentin蛋白的表达;RT-PCR法检测细胞内CIP4 mRNA表达水平;激光共聚焦显微镜观察CIP4在细胞内定位。体内实验以SD大鼠为研究对象,5/6肾切除法制作慢性肾纤维化模型;常规检测BUN和Scr水平;Masson染色检测肾组织纤维化水平;免疫组化法检测肾组织内CIP4蛋白的表达和分布。脂质体法介导含野生型CIP4的重组真核表达质粒pcDNA3.1-CIP4或pcDNA3.1-Zeo（空载体）转染HK-2细胞,Wetern 印迹法检查转染的效率。稳定转染成功后,Wetern 印迹法检测正常组、pcDNA-CIP4转染组和空载体转染组细胞内E-cadherin、vimentin蛋白的表达和β-catenin酪氨酸磷酸化水平。 结果 正常HK-2细胞表达E-cadherin和少量的CIP4,几乎不表达vimentin。TGF-β1干预组细胞vimentin蛋白表达增加（P ＜ 0.05）,E-cadherin蛋白表达减少（P ＜ 0.05）,CIP4 mRNA和蛋白表达均显著增多（P ＜ 0.05）。CIP4在正常细胞内大部分在细胞膜,少量在细胞质,在转分化的HK-2细胞表达显著增多,并向细胞质和细胞核聚集。假手术组大鼠肾功能正常,肾组织内未见明显纤维化组织,CIP4在肾小管表达较少,肾小球内几乎不表达;模型组大鼠BUN和Scr增高,肾组织内可见明显纤维化组织,CIP4在肾小管表达明显增加。pcDNA3.1-CIP4转染组较正常组和空载体转染组细胞内CIP4表达增多（P ＜ 0.05）,β-catenin酪氨酸磷酸化水平和vimentin蛋白表达增加（P ＜ 0.05）,而E-cadherin蛋白表达减少（P ＜ 0.05）。 结论 CIP4高表达可能参与肾小管上皮细胞-间充质细胞转分化,促进肾间质纤维化。     

CIP4在肾间质纤维化中的表达及作用

Objective To observe the expression and localization of CIP4 (Cdc42 interacting protein-4) in the renal fibrosis and the effect of CIP4 on the expression of E-cadherin,vimentin and β-catenin tyrosine phosphorylation. Methods In vitro, the human tubular epithelial cells (HK-2 cell line) were cultured with 10 μg / L TGF-β1 for 72 h. The protein expressions of CIP4, E-cadherin, vimentin and β-catenin tyrosine phosphorylation were measured by Western blotting; the expression of CIP4 mRNA was detected by RT-PCR. The intracellular distribution of CIP4 was observe by confocal microscope. In vivo, Masson staining was used to evaluate the level of renal fibrosis; the expression and distribution of CIP4 in renal tissue were detected by immunohistochemistry. HK-2 cells were transfected with pcDNA3. 1-CIP via lipofectamine 2000. The expressions of E-cadherin, vimentin and β-catenin tyrosine phosphorylation level in the transfected cells were detected by Western blotting. Results The expressions of CIP4 mRNA and protein were up-regulated in renal tubular EMT cells. Most of CIP4 protein localized in cell membrane, and some was in cytoplasm. After stimulation by TGF-β1, the expression of CIP4 protein both in cytoplasm and nucleus was greatly increased (P ＜0.05),especially in cytoplasm. In vivo, CIP4 was expressed in renal tubular epithelia, but little expressed in glomeruli. In renal from 5/6 nephrectomized rats, CIP4 expression was significantly increased. In the CIP4 transfectants, the expression of CIP4, vimentin and β-catenin tyrosine phosphorylation level were up-regulated (P ＜0.05), but E-cadherin expression was suppressed (P ＜0.05).Conclusion The overexpression of CIP4 is likely to take part in the epithelial-to-mesenchymal transition process, thereby promoting the renal fibrosis.     

小剂量利妥昔单抗治疗难治性肾病综合征2例并文献复习

目的通过2例典型病例结合文献复习探讨利妥昔单抗(RTX)治疗难治性肾病综合征(RNS)的作用机制、疗效及存在的问题。方法对华中科技大学同济医学院附属同济医院肾内科收治的2例RNS患者的临床资料及采用小剂量RTX治疗后的疗效进行回顾性分析,并对相关文献进行复习。结果 1例患者经肾活检诊断为II期膜性肾病,在经过糖皮质激素及常用免疫抑制剂(环磷酰胺、他克莫司、霉酚酸酯)治疗无明显好转的情况下,给予RTX100 mg/月治疗3个月后患者白蛋白明显升高,血肌酐下降,估算肾小球滤过率增加,尿蛋白显著减少,达到部分缓解。另1例患者糖皮质激素联合(霉酚酸酯、环磷酰胺、他克莫司)治疗可以缓解,但是减量过程中频繁复发,给予单次RTX100 mg治疗后患者白蛋白升至正常,尿蛋白转阴,达到完全缓解。2例患者治疗过程中没有出现明显不良反应。结论小剂量RTX治疗RNS是安全有效的。     

Erbin在肾间质纤维化中的表达和作用

目的 探讨Erbin在肾脏间质纤维化中表达量的变化及上调Erbin对转化生长因子β1（TGF-β1）诱导大鼠近端肾小管上皮细胞（NRK52E）转分化的影响。 方法 体内实验采用SD大鼠5/6肾切除法建立肾纤维化动物模型,收集并检测各组血清中Scr、BUN水平;Masson染色观察肾间质纤维化程度;免疫组化及Western印迹检测Erbin的分布与表达。 体外实验采用TGF-β1（10 μg/L）刺激NRK52E细胞72 h建立上皮细胞-间充质转分化（EMT）细胞模型;免疫荧光及Western印迹法检测E钙黏蛋白（E-cadherin）和α平滑肌肌动蛋白（α-SMA）的表达变化;RT-PCR及Western 印迹法检测Erbin的表达变化。用脂质体2000将质粒 Prk5-myc-Erbin瞬时转染至NRK52E细胞,Western印迹法观察上调Erbin表达后对上述各种指标的影响。 结果 （1）假手术组大鼠肾功能正常[Scr（33.96±7.28） μmol/L、BUN（8.11±2.55） mmol/L],Masson染色未见肾间质纤维化,Erbin在肾小管表达较少;模型组大鼠Scr [（140.52±61.11） μmol/L]、BUN[（34.23±7.66） mmol/L] 均显著高于假手术组（均P < 0.05）,肾间质可见明显纤维化,Erbin 在肾小管表达也明显增加,是假手术组的2.9倍（P < 0.01）。（2）正常NRK52E 细胞表达E-cadherin,少量表达Erbin和α-SMA。TGF-β1刺激后,NRK52E细胞E-cadherin表达显著减少,Erbin和α-SMA则表达增加（均P < 0.05）;而转染质粒Prk5-myc-Erbin可逆转TGF-β1诱导的NRK52E细胞E-cadherin表达下调,并可抑制α-SMA表达上调（均P < 0.05）。 结论 Erbin在肾间质纤维化中表达增加,上调Erbin表达可抑制TGF-β1诱导NRK52E发生EMT, 提示Erbin在肾脏纤维化中可发挥保护作用。