联合应用软骨再生支架与突变型HIF-1α修饰BMSCs分泌的外泌体对晚期软骨缺损修复的促进作用

目的：探讨突变型低氧诱导因子1α（HIF-1α）修饰骨髓间充质干细胞（BMSCs）分泌的外泌体对软骨细胞的保护作用,阐明其联合软骨再生支架促进晚期软骨缺损修复的可能机制。方法：采用超速离心法从野生型HIF-1α和突变型HIF-1α修饰的BMSCs中分别提取外泌体（BMSCs-Exo^WT与BMSCs-Exo^MU）,同时对其进行鉴定。在体外,采用白细胞介素1β（IL-1β）诱导软骨细胞发生炎症反应,分别将等量PBS、BMSCs-Exo^WT（80 mg·L^-1）和BMSCs-Exo^MU（80 mg·L^-1）分别与炎症反应下的软骨细胞共培养,实验分为空白组、炎症组、BMSCs-Exo^WT组和BMSCs-Exo^MU组,利用Hoechst33342染色检测各组软骨细胞凋亡小体数目;应用Western blotting法检测各组软骨细胞中AKT/p-AKT、ERK/p-ERK和p38/p-p38表达水平。12只新西兰兔随机分为4组,建立兔膝关节软骨缺损模型,分别将等量的生理盐水、支架+生理盐水、支架+BMSCs-Exo^WT和支架+BMSCs-Exo^MU作用于4组兔软骨缺损处。术后6周取材,通过大体观察、苏木素-伊红（HE）染色和蕃红O-固绿染色观察和比较各组软骨缺损的修复效果。结果：成功提取并鉴定BMSCs-Exo^WT与BMSCs-Exo^MU,电镜观察外泌体形态为近圆形,直径为40~100nm;Western blotting法显示两者分别表达特异性蛋白CD63和CD81。在体外实验中,炎症环境下BMSCs-Exo^MU组软骨细胞凋亡小体数目低于炎症组和BMSCs-Exo^WT组（P<0.01）;Western blotting法,BMSCs-Exo^MU组和BMSCs-Exo^WT组软骨细胞中p-ERK1和p-ERK2水平低于炎症组（P<0.05）,p-AKT和p-p38水平高于炎症组（P<0.05）;且BMSCs-Exo^MU的作用强于BMSCs-Exo^WT（P<0.05）。在兔膝关节晚期软骨缺损模型中,支架+BMSCs-Exo^MU组缺损处修复效果优于空白组、支架组和支架+BMSCs-Exo^WT组。结论：软骨支架与BMSCs-Exo^MU共同作用于软骨缺损处可促进缺损修复。