Nacl溶液、平衡盐溶液和磷酸盐缓冲液的细胞毒性研究

药物进入临床前在进行毒理学研究时需要通过细胞实验和动物实验找到药物最低有效浓度和药物最高安全浓度，因此，需要一种液体对药物进行浓度梯度稀释，而稀释液的成分将直接影响实验结果。同时，针对用药方式和用药部位的不同应选取不同的稀释液，当研究一种用于眼部直接给药的新药时，需要根据眼部特殊的生理需求进行实验设计，只有这样才能得到切实有效的结果。     

表皮生长因子对氧化损伤的人眼Muller细胞增生及迁移的保护作用

背景目前认为氧化损伤机制在年龄相关性黄斑变性（AMD）的发病中起着重要作用,主要与血一视网膜屏障的破坏有关,而Mailer细胞是稳定血一视网膜内屏障功能的主要细胞成分。研究表明,表皮生长因子（EGF）可促进实验动物视网膜Muller细胞的增生和迁移,但其对人Muller细胞的作用研究较少。目的探讨EGF对体外氧化损伤的人眼Muller细胞增生和迁移的影响及其作用机制。方法将人眼Maller细胞系MIO—M1细胞进行培养并用胶质纤维酸性蛋白（GFAP）、第Ⅷ因子、a-平滑肌肌动蛋白（Ot—SMA）、人角蛋白及S-100免疫组织化学法进行鉴定。在无血清DMEM中加入不同质量浓度（0、1、10、30、100mg／L）EGF,用5-溴脱氧尿嘧啶核苷（BrdU）标记法测定MIO—M1细胞的阳性率。根据干预方式的不同将培养细胞分为EGF组、H2O2损伤组、EGF＋H2O2组、葡萄糖氧化酶（GO）组、GO＋EGF组、EGF＋LY294002＋H2O2组,采用MTT比色法测定各组培养细胞的增生情况（A590）。对培养的人眼Muller细胞采用划痕实验观察H2O2损伤条件下0、1、10、30、100mg／LEGF作用24、48、72h后对Miiller细胞增生、迁移的影响;采用Westernblot技术检测EGF对体外不同培养条件下MUller细胞Akt信号传导通路的作用。结果正常培养条件下10、30、100mg／LEGF作用后Muller细胞的增生率分别为28．0％、32．9％、39．O％,明显高于0mg／L、1mg／LEGF组（24．5％、26．2％）。在H2O2和GO分别培养细胞的条件下,高质量浓度的EGF组Muller细胞的吸光度（A570）值明显大于低质量浓度组,各组总体差异有统计学意义（F=23．582,P=0．000）。与EGF＋H2O2组比较,EGF＋LY294002＋H2O2组Muller细胞的吸光度（A570）值明显下降。10mg／LEGF促进Muller细胞迁移的作用最强。0．08mmol／L H2O2作用Mfiller细胞后Akt信号通路激活,提前2h加入外源性EGF后,100mg／LEGF对抗氧化所致Mtiller细胞的损伤作用最明显,同时提前2h加入外源性EGF和Akt信号通路阻断剂LY294002后,Akt信号传导通路的保护作用减弱。结论EGF对体外培养的Muiler细胞具有促进增生及迁移的作用,10mg／LEGF促进Muller细胞迁移作用最强。100mg／L外源性EGF抗Muller细胞氧化损伤作用最强,其作用机制是激活Akt信号传导通路。     

促红细胞生成素抑制氧化损伤诱导的人眼Müller细胞凋亡

目的探讨促红细胞生成素(EPO)抑制氧化损伤导致的Müller凋亡的可能性及其分子机制。方法对培养的人眼Müller细胞系MIO-M1细胞采用Brd U标记法和MTT比色法观察正常及过氧化氢(H2O2)或葡萄糖氧化酶(GO)氧化损伤条件下0、0.01、0.1、1、10、30、100 U/m L EPO作用24、48、72 h后对Müller细胞增殖、迁移的影响;采用MTT比色法观察加PI3K/PDK1/PKB(Akt)信号传导通路阻断剂LY294002后Müller细胞增殖的变化;采用ELISA实验观察Müller细胞对EPO的表达和分泌;通过Western-blotting技术检测体外不同条件培养下EPO对ERK1/2及Akt信号传导通路的作用。结果正常培养条件下,EPO有轻度促进Müller细胞增殖迁移的作用,但差异无统计学意义;正常培养条件下,Müller细胞自身不分泌EPO,0.4 mmol/L H2O2致Müller细胞损伤80%时,其培养液内EPO的表达量为正常培养液下的1.42倍;氧化损伤状态下,0.08 mmol/L H2O2或8 U/L GO作用Müller细胞24 h后导致其半数死亡且Akt信号通路激活;提前2 h加入外源性EPO后,发现30 U/m L EPO对抗氧化所致Müller细胞的损伤作用最明显;同时提前2 h加入Akt信号通路阻断剂LY294002后,Akt信号传导通路的保护作用被阻断减弱。结论 EPO对体外正常培养的Müller细胞不具有促进增殖迁移作用;正常培养条件下Müller细胞自身不表达并且不分泌EPO,氧化损伤条件下Müller细胞自身可低分泌EPO;加入外源性EPO后,EPO可能通过Akt信号传导通路对H2O2损伤的Müller细胞发挥保护作用。     

姜黄素对过氧化氢诱导的血管内皮细胞损伤的双重作用

目的研究姜黄素(Cur)对过氧化氢(H2O2)诱导的血管内皮细胞ECV304的作用及可能机制;方法胎盘兰计数法分组观察在不同的时间点加入姜黄素后对H2O2诱导的ECV304细胞氧化损伤的作用。流式细胞仪分析细胞周期及细胞凋亡率的变化,试剂盒检测一氧化氮(NO)、丙二醛(MDA)含量及超歧化物氧化酶(SOD)、谷胱甘肽还原酶(GR)活性的变化。结果姜黄素0~100μmol·L-1与H2O2500μmol·L-1同时作用5h,随姜黄素浓度升高细胞存活率升高;25~100μmol·L-1姜黄素预先作用1h,再换为H2O2500μmol·L-1作用4h,细胞存活率明显下降;H2O2500μmol·L-1作用4h,再加入25~100μmol·L-1姜黄素作用1h,细胞存活率也升高。姜黄素对H2O2诱导的细胞凋亡没有明显的影响,但同时作用组、H2O2先作用组S期细胞所占比例升高,姜黄素先作用组S期细胞所占比例下降。同时作用组、H2O2先作用组的SOD、NO、GR水平相对升高,MDA水平下降,姜黄素先作用组的SOD、NO、GR水平相对下降,MDA水平升高。结论姜黄素对H2O2诱导的血管内皮细胞ECV304有双重效应,即有保护效应也有细胞毒效应,与其作用时间点有关。     

苦参碱对人宫颈癌Hela细胞的增殖抑制作用研究

目的探讨苦参碱对人宫颈癌细胞株Hela细胞体外增殖的抑制作用。方法选用人宫颈癌Hela细胞进行体外培养,以0.25～4.0mg/ml的苦参碱分别处理Hela细胞24～72h后,用MTT法检测细胞生长抑制率,流式细胞仪检测细胞凋亡率,倒置显微镜和透射电镜进行形态学观察。结果苦参碱对Hela细胞有抑制作用,并呈剂量和时间依赖性;流式细胞仪检测到细胞在苦参碱作用后,细胞凋亡率增加;透射电镜观察发现部分细胞发生凋亡早期改变。结论苦参碱对人宫颈癌Hela细胞具有明显抑制作用,诱导细胞凋亡可能是其机制之一。     

腺苷对人肺腺癌细胞A549增殖和细胞周期的影响

目的：探讨腺苷对人肺腺癌细胞株A549增殖和细胞周期的影响。方法：体外培养肺腺癌细胞株A549,采用RT-PCR方法检测腺苷受体mRNA在A549细胞中的表达情况。以0、1、10、100和1 000μmol/L的腺苷分别作用A549细胞24、48和72 h后,采用MTT方法检测细胞光密度值,分析不同时间、不同浓度的腺苷对A549细胞存活率的影响。以100μmol/L的腺苷作用A549细胞24 h,采用流式细胞术检测其细胞周期。对上述所得数据进行单因素方差分析和独立样本t检验。结果：四种腺苷受体A1、A2A、A2B和A3在A549细胞中均有表达。MTT结果显示,作用时间24 h,各腺苷处理组（1、10、100和1 000μmol/L）细胞存活率分别为91%、84%、80%、73%;作用时间48 h,各腺苷处理组细胞存活率分别为82%、69%、58%、55%;作用时间72 h,各腺苷处理组细胞存活率分别为86%、56%、52%、38%,表明腺苷对A549细胞具有生长抑制效应,抑制率随着腺苷浓度升高而增强。与对照组相比,100μmol/L腺苷作用于A549细胞24 h后,能增加G1期细胞比例（对照组：59.07±0.70;100μmol/L：65.05±0.62,t=-11.04,P〈0.01）,并减少G2期细胞比例（对照组：6.67±0.95;100μmol/L：1.29±0.43,t=8.89,P〈0.01）。结论：腺苷能够抑制人肺腺癌细胞A549的生长,并改变其细胞周期分布。     

腺苷对葡萄膜黑色素细胞和葡萄膜黑色素瘤细胞增殖的影响

目的探讨腺苷受体在正常人葡萄膜黑色素细胞和葡萄膜黑色素瘤细胞中的表达以及腺苷对其细胞增殖能力的影响。方法体外培养正常人葡萄膜黑色素细胞（U95）和葡萄膜黑色素瘤细胞（$65）,采用Real—timePCR检测4种不同亚型腺苷受体（、A1、A2A、A2B、A3）mRNA在U95和S65中的表达情况。以0、0．1、1、10和100μmol／L的腺苷分别作用U95和S65细胞24h和48h后,采用MTT法检测细胞光密度值和抑制率,分析不同时间、不同浓度的腺苷对U95和S65增殖能力的影响。对上述所得数据进行单因素方差分析或独立样本t检验。结果U95和S65细胞中4种类型腺苷受体A1、A2A、A3的mRNA均有表达。在U95细胞中,A1、A孙A2B、A3受体mRNA表达值分别为1．32±0．47、0．28±0．05、1．03±0．10、0．20±0．07,四者之间差异有统计学意义（F=15．90,P〈0．01）,A1和A2B的mRNA表达水平相似,且明显高于A2A和凡的表达;在$65细胞中,A1、A2A、A3气受体mRNA表达值分别为1．03±0．27、2．23±0．35、127．34±18．69、0．17±0．07,四者之间差异有统计学意义（F=163．20,P〈0．01）,A2HmRNA表达水平明显高于其他3种腺苷受体亚型。A2A和A。在S65中的表达明显高于其在U95中的表达量（A2A：t=9．35,P〈0．0l;A2B2Bt=11．43,P〈0．01）。作用时间24h,0．1、1、10和100μmol／L腺苷对S65细胞的抑制率分别为3．47％、14．93％、19．79％和26．04％：作用时间48h,各浓度腺苷对S65细胞的抑制率分别为11．43％、23．10％、34．76％和46．67％;随着腺苷浓度的增高,S65细胞的增殖受到明显的抑制,呈现明显的浓度效应依赖关系。而腺苷对U95细胞的增殖无明显影响。结论腺苷能够明显抑制葡萄膜黑色素瘤细胞的增殖,但不影响正常葡萄膜黑色素细胞的生长。腺苷和／或腺苷受体激动剂也许可以作为一种新的药物用于葡萄膜黑色素瘤的治疗。     

表皮生长因子对人眼Müller细胞增生迁移的影响及其作用机制

背景研究证实表皮生长因子（EGF）可促进鼠视网膜Müller细胞的增生和迁移,但EGF能否促进人眼Müller细胞的增生迁移尚未见报道。目的探讨人眼Müller细胞能否自身表达和分泌EGF及EGF对Müller细胞增生迁移的影响及其作用机制。方法同一代人永生株Müller细胞系MIO—M1细胞用高糖DMEM进行培养,利用MTT比色法观察不同质量浓度EGF作用24、48、72h,不同浓度CoCl2作用12h和24h,加入导致Müller细胞半数致死量的CoCl,浓度前2h加入不同质量浓度EGF的Müller细胞增生情况;Transwell小室观察正常及CoCl2缺氧条件下用不同质量浓度EGF作用24、48、72h后Müller细胞的迁移情况;采用ELISA法观察Müller细胞表达和分泌EGF的情况;通过Westernblot法检测体外不同条件培养下EGF对ERK1/2及Akt信号转导通路的作用。结果正常培养条件下,不同质量浓度的EGF作用后Mfiller细胞的吸光度（A570）值的总体比较差异有统计学意义（F=123．765,P=0．000）,100mg／LEGF促Müller细胞增生作用最强,为对照组的1．6倍,10mg／LEGF促Müller细胞迁移的作用最强,为对照组的4．5倍。各EGF组Müller细胞的A570,值均明显高于对照组,差异有统计学意义（P〈O．01）。缺氧条件下培养,Müller细胞半数致死量的CoCl2浓度为600nmol／L,提前2h加入10～100阻g／LEGF后,EGF对抗缺氧所致Muller细胞的损伤作用最明显。700nmol／LCoCl2致Müller细胞损伤80％时其自身低分泌7．8ng／LEGF。10～100mg／LEGF作用Müller细胞促增生迁移作用信号最明显,600nmol／ LCoCl2作用Müller细胞24h后ERKl／2及Akt信号强度减弱,提前2h加入外源性EGF后,ERK1／2及Akt两条信号通路最明显。结论EGF能以剂量依赖的方式促进体外培养的Müller细胞增生及迁移。正常培养条件下的Müller细胞自身不表达,缺氧条件下Müller细胞自身可少量分泌EGF。EGF可能通过ERK1／2及Akt信号转导通路介导Müller细胞的增生和迁移,并对CoCl2损伤的Müller细胞发挥保护作用。     

三氧化二砷对表皮生长因子诱导的视网膜色素上皮细胞增生和迁移的影响

背景 细胞因子失衡所导致的视网膜色素上皮(RPE)细胞的异常增生和迁移是增生性玻璃体视网膜病变( PVR)的主要病理变化之一.三氧化二砷(As2O3)是中国传统中药中的有效成分,可有效抑制肿瘤细胞的增生和迁移.但As2O3对细胞生长因子引起的RPE细胞增生和迁移的影响尚未明确. 目的 探讨As2O3对表皮生长因子(EGF)诱导的ARPE-19细胞增生和迁移的影响.方法 用无血清培养基对RPE细胞系ARPE-19细胞进行培养,将终浓度为0、0.5、1.0、2.0、5.0、10.0和20.0 μmol/L的As2O3分别加入到无血清培养基和含10 mg/L EGF的ARPE-19细胞培养液中作用24 h和48 h,通过噻唑蓝(MTT)比色法检测各培养组ARPE-19细胞活性的吸光度(A)值,以探讨As2O3对细胞的药物毒性作用,并筛选安全、有效的As2O3作用浓度.用10 mg/L EGF加入培养基诱导ARPE-19细胞迁移,分别在培养板中加入0、0.5、1.0、2.0μmol/L As2O3 作用24 h和48 h,并通过划痕试验和Transwell试验检测As2O3对EGF诱导的ARPE-19细胞迁移的影响.结果 MTT法检测发现不同浓度As2O3组作用24 h和48 h后,无血清培养组细胞A值随As2O3浓度的升高而逐渐下降,总体差异有统计学意义(F浓度=38.269,P=0.000;F时间=0.874,P=0.358).与空白对照组(0μmol/LAs2O3组)比较,0.5～ 5.0 μmol/L As2O3组ARPE-19细胞A值的差异均无统计学意义(P＞0.05).对含10 mg/LEGF组的ARPE-19细胞,药物对细胞A值的影响呈现浓度和时间依赖性(F浓度=152.155,P=0.000;F时间=51.649,P=0.000).与对照组比较,0.5～2.0μmol/L As2O3加入24 h和48 h后,A值的变化差异均无统计学意义(P＞0.05),而0.5、1.0、2.0μmol/L As2O3加入10 mg/L EGF诱导的ARPE-19细胞中作用24h和48 h后,A值的变化差异均无统计学意义(F浓度=2.215,P=0.126;F时间 =2.230,P=0.155).5.0 ～20.0 μmol/L As2O3作用于EGF诱导的ARPE-19细胞中作用后,细胞A值明显下降,与空白对照组比较差异均有统计学意义(P＜0.05),5.0～20.0 μmol/L As2O3作用24 h后,对EGF诱导的ARPE-19细胞增生抑制率分别为12％、32％、37％;作用48 h后细胞抑制率分别为39％、44％和53％.划痕试验结果显示,0.5～2.0 μmol/L As2O3对EGF诱导的ARPE-19细胞的横向迁移具有抑制作用.Transwell试验结果表明,0.5～2.0 μmol/L As2O3对10 mg/L EGF诱导的ARPE-19细胞纵向迁移有明显的抑制作用,0.5、1.0、2.0μmol/L As2O3作用12h对ARPE-19细胞的抑制率分别为22％、33％和46％. 结论 As2O3在一定浓度范围内对ARPE-19细胞无毒性作用,2.0 μmol/L以下浓度的As2O3对EGF诱导的ARPE-19细胞增生无明显影响,但可影响细胞的迁移能力,5.0 μmol/L以上浓度的As2O3可明显抑制ARPE-19细胞的增生.