基因工程杂交酵母艾滋病疫苗研究

目的 对以酵母为载体所制得的艾滋病候选疫苗进行研究。方法 构建表达Gag及IL-2的质粒载体，将表达载体分别转化入酵母细胞，通过酵母杂交获得同时表达两种基因的酵母杂交体，放大培养后经灭活、分装、冻干，制得细胞干粉作为试验的疫苗。用小鼠及食蟹猴对试验疫苗进行有效性及安全性研究。结果 杂交酵母可以稳定表达Gag及IL-2；经皮下注射可以分别在小鼠及食蟹猴体内诱导一定水平的细胞免疫反应；对小鼠肿瘤模型的研究表明，疫苗可以诱导有效的免疫保护反应；疫苗的安全性良好，没有明显的毒副作用，只在注射部位引起轻微的红肿，个别动物有低热反应，但均在一周左右恢复正常。结论杂交酵母艾滋病疫苗具有诱导细胞免疫反应的能力；杂交酵母载体疫苗在相关疾病的治疗方面有良好的应用前景。     

新生儿苯丙氨酸荧光分析法的建立及其试剂盒的临床评价

目的建立新生儿苯丙氨酸荧光分析法并评价其试剂盒性能。方法以滤纸为载体制备标准品和质控品干血片,琥珀酸盐缓冲液、L-亮氨酸-L-丙氨酸二肽和茚三酮溶液作为反应液,硫酸铜为主要成分的溶液作为增强剂和稳定剂,应用荧光定量法检测新生儿滤纸干血片中的苯丙氨酸,并对方法进行性能评价。比对试验采用线性回归分析,配对计数资料结果的一致性采用Kappa检验分析。结果自研试剂的曲线线性相关系数r大于0.99,检测限不高于0.5mg/dl,标准品的效价比在0.9667～1.0060,批内、批间的变异系数均不高于10%,20mg/dl以内的常见的氨基酸干扰物对检测方法无明显影响;2～8℃保存的试剂可以稳定13个月;与国外试剂比对,回归方程为Y(自研试剂盒)=0.8565X(AniLabsystemsKIT)+0.1448,r=0.9853;不同包装规格的试剂比对检测,线性回归方程Y(96人份/盒)=1.0101X(960人份/盒)-0.0098,r=0.9854。国内外的检测仪器比对检测,回归方程为Y(TAKEEN)=1.011X(1420)-0.0058,r=0.9948;Y(TAKEEN)=1.027X(FLUOROSKAN)-0.011,r=0.9937;参考值定为2.0mg/dl;临床研究评价一致程度百分比可达99.81%。结论自研试剂盒灵敏度高,特异性强,准确度好,精密度好,稳定性良好,与AniLabsystems的试剂盒比对试验检测结果的相关性好,符合率高,不同包装规格的试剂盒分析性能一致,并且适合于国内外的检测仪器,自建方法和自研试剂盒能满足临床新生儿苯丙酮尿症筛查的需要。     

自建新生儿苯丙氨酸荧光定量检测系统的应用评价

目的 为推动国内新生儿苯丙嗣尿症(PKU)筛查技术的发展和新生儿PKU筛查的普及,自建新生儿苯丙氨酸荧光定量检测系统,并对自建系统进行基本的分析性能进行评价.方法 参考美国临床实验室标准化委员会(NCCLS)文件和相关文献,以labsystems配套检测系统作为可溯源参比系统,对自建系统的精密度、灵敏度、线性进行评价,并用临床样本进行比对试验和偏倚评估,回归相关系数大于0.975,偏倚以中国卫生部临检中心苯丙氨酸室间质评的1/4允许系统误差(靶值±30%)作为检测系统可比性的临床接受标准;通过检测1 353例正常新生儿样本,建立参考值,并对引用参考值进行确认.结果 自建检测系统分析内、分析间不精密度均小于15%;检测灵敏度为0.55 mg/dl;在1.00～15.00 mg/dl内,回归系数r=0.999 1;与参比系统比对试验回归方程为Y(自建)=1.007 8X(参比)-0.041 6,r=0.998 7,相对偏倚小于7.50%.参考值可以直接引用2.00 mg/dl作为切值判断.结论 自建新生儿苯丙氨酸荧光定量检测系统的基本性能可以满足临床需要,值得推广应用.     

时间分辨荧光免疫法检测HBVPreSIAg试剂盒的应用评价

目的建立乙型肝炎病毒前S1抗原（HBVPreSlAg）时间分辨荧光免疫法（TrFIA）,并对自研试剂盒检测PreSlAg的应用价值进行评价。方法对自研试剂盒的精密度、灵敏度、特异度、稳定性和参考值等分析性能指标进行评价;与对照试剂盒平行检测l020例样本,检验结果的一致性采用Kappa检验。采用时间分辨荧光免疫法检测PreSlAg和乙型肝炎病毒标志物（HBVDNA）,用荧光定量聚合酶链反应（PCR）检测HBVDNA,探讨PreSlAg与HBVDNA之间的相关性并对比三者在临床样本中的阳性检出率。结果自研试剂盒符合企业内部栓定标准,批内变异系数小于10％,自研试剂盒灵敏度较酶联免疫法高,有效期为12个月;自研试剂盒与对照试剂盒检测结果的总符合率达98．82％,Kappa指数达0．9763;350例样本中PreSlAg检出率与HBVDNA检出率差异无统计学意义（x2=1．69,P〉0．05）;在HBVDNA阳性时PreSIAg与HBeAg的检出灵敏度一致（x2=0．21,P〉0．05）;但在HBVDNA阴性时特异性PreSlAg不及HBeAg（x2=50．24,P〈0．05）。PreSlAg和HBeAg的检出率均随HBVDNA浓度升高而升高;PreSIAg和HBeAg联合应用检出率（66．00％）高于HBVDNA检出率（49．43％）（x2=20．88,P〈o．05）。结论PreSlAg是反应HBV复制和传染性的一个重要补充标志物。自研试剂盒在预示HBV的感染、复制和传染性等方面具有重要的价值。     

时间分辨荧光免疫法乙型肝炎病毒e抗原定量测定试剂盒的研制与性能评价

目的 对自研时间分辨荧光免疫法(TRFIA)乙型肝炎病毒e抗原(HBeAg)定量测定试剂盒进行性能评价.方法 2株单克隆抗体分别用于固相包被和铕标记,固相双抗体夹心二步分析法检测人血清HBeAg,并对自研试剂盒线性范围、精密度、分析灵敏度、特异度等进行评价,与对照试剂盒平行检测1 020例样本,检验结果采用线性回归分析,一致性采用Kappa检验.结果 自研试剂盒线性范围为0.60～160 NCU/mL,相关系数达0.99,批内和批间变异系数均小于10%,灵敏度达0.05 NCU/mL,检测国家标准物质或自制参考品的效价比为0.90～1.10,检测国家参考品符合国家的质量检定标准,37 ℃恒温箱烘烤6 d后检测性能无明显改变,与同类试剂检测结果线性相关系数达0.95,临床研究试验总符合率达100%,Kappa指数为1.结论 自研试剂盒精密度好、灵敏度高、准确性好、线性范围宽、符合率高,可取代对照试剂盒,值得推广应用.     

丙型肝炎病毒抗体桥式双抗原夹心时间分辨荧光免疫分析法的建立

目的建立丙型肝炎病毒抗体桥式双抗原夹心时间分辨荧光免疫分析法。方法采用丙型肝炎病毒基因重组多表位嵌合蛋白作为包被抗原,生物素标记抗原作为桥接抗原,链霉亲和素标记铕作为示踪物,配制以β-萘甲酰三氟丙酮为主要成分的增强液,自建方法的校准品以国家标准血清物质GBW（E）090047为溯源,应用桥式双抗原夹心法建立丙型肝炎病毒抗体时间分辨荧光免疫分析法。结果自建方法在0．031—4．00NCU／ml内,相关系数可达0．99;分析内和分析间变异系数均小于10％;灵敏度可达0．016NCU／ml;校准品的效价比在0．90～1．10,平均回收率为101．47％;与相关疾病的抗原或抗体无明显交叉反应,其表观浓度值均小于0．03NCU／ml;参考值为0．05NCU／ml;符合国家检定标准的要求;37℃恒温箱烘烤7d后检测性能无明显改变;与同类方法学比对符合性好。结论自建方法精密度好,灵敏度高,特异性强,准确性好,线性范围宽,符合率高,能满足临床检测需要。     

血清甲胎蛋白和游离β绒毛膜促性腺激素双标记时间分辨荧光免疫试剂盒的研制与评价

目的 研制一种用于产前筛查的母血清甲胎蛋白(AFP)和游离β绒毛膜促性腺激素(free hCG β)双标记时间分辨荧光免疫法(TrFIA)试剂盒.方法 采用AFP单克隆抗体铕(Eu3+)标记物和free hCGβ单克隆抗体钐(Sm3+)标记物作为示踪物,以β-萘甲酰三氟丙酮为主要成分制备增强液,应用双抗体夹心法研制出hAFP和free hCG β双标记时间分辨荧光免疫法试剂盒,并对其进行分析性能评价,平行比对试验采用线性回归分析.结果 自制试剂盒AFP和free hCG β的剂量-反应曲线线性相关系数(r)可达0.999 0以上;批内、批间CV(%)均小于10.00%;AFP和free hCG β的灵敏度分别为0.12 U/ml和0.08 ng/ml;以国家标准品为对照,AFP和free hCG β的标准品效价比在0.900～1.100间;检测AFP和free hCG β的线性范围分别为0.25 U/ml～500 U/ml和0.2 ng/ml～200 ng/ml;试剂盒在4℃保存下可至少稳定12月;与国外同类试剂比对,AFP和free hCG β的回归方程的线性相关系数(r)分别为0.973 0和0.992 7.结论 自制试剂盒具有灵敏度高、特异性强、准确度好、线性范围宽等优点,与国外的同类产品检测结果相关性好,能满足临床需要.     

游离甲状腺素时间分辨荧光免疫试剂盒的研制

目的研制一种人游离甲状腺素(FT4)时间分辨荧光免疫分析法(TRFIA)试剂盒。方法采用直接竞争法建立FT4检测方法(固相包被T4-复合物,与样本中的FT4竞争结合Eu标记的T4单克隆抗体),并对该试剂盒各项性能指标进行评价。结果该试剂盒的分析灵敏度为不高于2.0pmol/L,工作范围为2.0～120.0pmol/L。分析内变异系数为4.4%～5.7%、分析间变异系数为6.5%～8.2%,其总变异系数小于9.0%。与T3、FT3、rT3和rT4的交叉反应率分别为:1.12%、0.34%、0.56%和1.51%。稳定性试验表明该试剂盒可以在2～8℃稳定1年,37℃稳定7d。用该试剂盒对500份健康人血清标本进行测试,统计该试剂盒的正常参考值范围是11.5～22.7pmol/L。200份血清标本用本试剂盒与国外的化学发光试剂盒同时检测FT4,其相关系数为0.993。结论该试剂盒各项指标均达到临床检测要求,可替代国外化学发光法的同类产品试剂盒。     

癌胚抗原时间分辨荧光免疫分析法的建立及方法学评价

目的建立癌胚抗原（CEA）时间分辨荧光免疫分析（TrFIA）法。方法采用两株CEA单克隆抗体（CEA McAb），一株用于固相包被（4．00μg/mL），另一株用于标记铕（Eu3＋）制备Eu3＋-CEAMcAb（1：1600），固相双抗体夹心二步分析法检测人血清中的CEA，并对此方法进行方法学评价。结果本方法与甲胎蛋白（AFP）和糖类抗原19—9（CA19—9）的交叉反应率分别为O．25％和3．58％，而与其他常用肿瘤标志物无交叉反应；低、中、高浓度的CEA质控批内实验变异系数分别为4．75％，4．25％和2．89％，批间实验变异系数分别为9．55％，7．38％和3．69％；平均回收率为95．94％；试剂盒37℃烘烤7d后检测性能基本稳定；并与CEA化学发光免疫分析技术（CLIA）比对试验结果相关系数达0．9986；CEA—TrFIA法检测系统的检测低限（LLD）、生物检测限（BLD）和功能灵敏度（FS）分别为0．4315ng/mL、1．000ng/mL和1．000ng/mL；线性范围为1．000～500．0ng/mL。结论CEA—TrFIA法具有灵敏度高、特异性强、精密性好、线性范围宽、试剂有效期长和非放射性等优点，具有良好的临床应用价值。