不同浓度转化生长因子β1体外诱导大鼠骨髓间充质干细胞向心肌样细胞分化的研究

目的:研究不同浓度转化生长因子-β1(TGF-β1)在体外定向诱导大鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs)向心肌样细胞分化的能力。方法:取SD大鼠四肢骨骨髓,密度梯度离心法分离大鼠BMSCs,以TGF-β1 5μg/L(低剂量组)、10μg/L(高剂量组)对第3代BMSCs进行体外诱导,未诱导的骨髓间充质干细胞做对照。相差显微镜观察细胞形态,MTS试剂盒检测细胞活性。分化14天后,流式细胞仪分析三组细胞DNA周期;免疫荧光法鉴定心肌肌钙蛋白I(cardiac troponin,c Tn I)、心肌平滑肌肌动蛋白(aactin)和心肌肌球蛋白重链(myosin heavy chain,MHC)的表达率。结果:三组细胞均呈对数生长趋势,诱导组细胞数量增长较对照组缓慢(P0.05),诱导组之间比较,细胞增长无明显差异。分析细胞DNA周期显示:诱导14天后,对照组增殖指数明显高于诱导组(P0.05),不同浓度诱导组之间比较,细胞增殖指数无明显差异。免疫荧光法检测结果显示:诱导14天后,诱导组细胞均部分表达c Tn I、α-actin及MHC,TGF-β1高剂量组细胞转化率高于低剂量组;对照组均不表达c Tn I、α-actin及MHC。结论:10μg/L TGF-β1与5μg/L TGF-β1比较,更有效促进BMSCs体外向心肌样细胞分化,且对细胞增殖活性无明显影响。     

碱性成纤维细胞生长因子体外诱导犬骨髓间充质干细胞向心肌样细胞分化

目的探讨不同剂量的碱性成纤维细胞生长因子体外定向诱导犬骨髓间充质干细胞（BMSCs）向心肌样细胞分化的可行性。方法采用密度梯度离心法分离犬BMSCs并进行传代培养。四甲基偶氮唑盐（MTT）法和流式细胞术检测第3代BMSCs的增殖及DNA周期;取第3代BMSCs设置对照组,碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）10、100μg·L^-1组进行体外诱导培养,镜下观察其形态变化,细胞生长曲线法检测细胞增殖情况;免疫荧光法鉴定心肌肌钙蛋白I（TnI）、肌球蛋白重链（MHC）和波形蛋白（Vimentin）的表达。结果密度梯度离心法得到的BMSCs呈长梭形、聚集性生长,第3代BMSCs MTT法检测结果显示细胞生长阶段为潜伏期、对数生长期及平台期。DNA周期检测结果:G₀/G₁期为（91.90±1.68）%,表明绝大部分细胞处于非增殖状态。经诱导分化3周后,3组细胞经生长曲线法检测结果显示:1³ d,bFGF10、100μg·L^-1组细胞数较对照组增殖明显,差异有统计学意义（P<0.05）;4⁵ d,对照组细胞呈对数生长趋势,bFGF 10、100μg·L^-1组细胞数量减少;6⁷ d,bFGF诱导组较对照组细胞数明显减少（P<0.05）,而bFGF 10μg·L^-1组与bFGF100μg·L^-1组比较细胞数量明显偏少（P<0.05）。免疫荧光法检测结果显示:经诱导分化4周后,bFGF 10μg·L^-1组和bFGF100μg·L^-1组的细胞均表达TnI和MHC,不表达Vimentin;对照组均不表达TnI、MHC和Vimentin。结论 10μg·L^-1bFGF能够有效促进BMSCs的体外增殖,并具有向心肌样细胞分化能力。     

冠状静脉逆行灌注碱性成纤维细胞生长因子的体内浓度梯度

背景：体外研究发现,碱性成纤维细胞生长因子浓度梯度能够促进干细胞的迁移和增殖。然而,采用冠状静脉逆行灌注途径能否建立在体碱性成纤维细胞生长因子浓度梯度尚不明确。目的：评价冠状静脉逆行灌注实验方法的安全性,建立并检测冠状静脉与局部缺血心肌间的碱性成纤维细胞生长因子浓度梯度,探讨逆行灌注后碱性成纤维细胞生长因子浓度梯度存在的时间窗。方法：开胸结扎法建立犬急性心肌梗死模型,1周后经冠状静脉逆行灌注碱性成纤维细胞生长因子。灌注结束后球囊充盈时间分别为0,5,10,15min。解除球囊充盈后即刻处死动物,ELISA法测量血浆和梗死区心肌、梗死边缘区心肌组织匀浆中碱性成纤维细胞生长因子的浓度,在体评价在不同时间点冠状静脉血液与梗死区心肌以及梗死边缘区心肌之间的碱性成纤维细胞生长因子浓度梯度。结果与结论：逆行灌注成功率为100％,无死亡、心脏压塞和恶性心律失常等并发症发生。灌注后5min和10min,冠状静脉血液与梗死区心肌之间碱性成纤维细胞生长因子浓度的差异有显著性意义,梗死区心肌浓度明显高于其他2种组织。球囊充盈15min后2组之间浓度差异无显著性意义。结果表明,经冠状静脉逆行灌注碱性成纤维细胞生长因子后,球囊充盈的时间为5-10min能在冠状静脉血液与梗死心肌之间建立稳定的碱性成纤维细胞生长因子浓度梯度,而且在梗死心肌区域浓度最高。此时间窗内灌注干细胞有望增强其移行活力。     

细胞生长因子对正常氧和低氧条件下犬骨髓间充质干细胞迁移的影响

目的观察比较正常氧和低氧环境下,不同细胞生长因子对犬骨髓间充质干细胞迁移的影响。
　　方法抽取犬骨髓,采用密度梯度离心法分离骨髓间充质干细胞并进行培养。在倒置显微镜下观察细胞的形态变化;取第3代细胞利用流式细胞术检测其表型特征;加入碱性成纤维细胞生长因子、血管内皮生长因子和胰岛素样生长因子-1,在正常氧和低氧条件下行迁移和划痕实验来观察细胞趋化能力。
　　结果细胞迁移情况与氧环境及细胞生长因子的存在和种类均有关联。碱性成纤维细胞生长因子、血管内皮生长因子和胰岛素样生长因子-1均能促进骨髓间充质干细胞的迁移,碱性成纤维细胞生长因子较其他细胞生长因子显示出更强的促进迁移作用,这种作用在低氧环境下更为明显。
　　结论低氧环境下骨髓间充质干细胞的迁移能力较正常氧环境下更强,碱性成纤维细胞生长因子、血管内皮生长因子和胰岛素样生长因子-1的存在均有利于骨髓间充质干细胞的迁移。     

采用OTW球囊经冠状静脉逆行灌注骨髓间充质干细胞的安全性和有效性

目的 探讨采用over-the-wire(OTW)球囊经冠状静脉逆行灌注骨髓间充质干细胞(MSCs)的安全性及有效性.方法 杂种犬12 只,体重(23.0±1.9)kg,采用开胸直视下完全结扎前降支(LAD)中段建立急性心梗模型.1 周后采用OTW 球囊将1×108 EGFP 标记的MSCs 灌注到与LAD 平行的前室间静脉(AIV)中段.所有实验动物分别在灌注后1 h(n=4)、14 d(n=4)、28 d(n=4)取材,比较LAD 结扎部位缺血心肌和LCX区域非缺血心肌组织中EGFP 阳性细胞的数量.结果 经冠状静脉逆行灌注成功率为100%(12/12),术中及术后未发生死亡、心包填塞及恶性心律失常.免疫荧光结果显示,所有时间点LAD 区域内EGFP 阳性细胞数均明显高于LCX 区域(均P<0.05),细胞在LAD 区域内的分布也更均匀.结论 采用OTW 球囊经冠状静脉逆行灌注MSCs 安全可行,靶向性高,细胞在缺血心肌内的分布也较为均匀、持久.     

冠状静脉逆行灌注碱性成纤维细胞生长因子对骨髓间充质干细胞向心肌内归巢的影响

目的 探讨经冠状静脉逆行灌注碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）对骨髓间充质干细胞（MSCs）心肌内归巢的影响.方法 杂种犬12只,体重20～25（22.4±1.8）kg,采用开胸结扎法建立急性心肌梗死模型.1周后将存活犬（n=ll）随机分为MSCs组（n=5）和bFGF＋MSCs组（n=6）.采用密度梯度离心与贴壁培养法在体外分离、培养MSCs,移植前对MSCs进行4’,6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）孵育标记.逆行灌注实验后1周,免疫荧光法比较两组梗死心肌内DAPI阳性细胞数,评价逆行灌注bFGF对MSCs归巢的影响.结果 采用密度梯度离心和贴壁培养法成功分离并富集MSCs,77.19％以上的细胞都处于G0/G1期,强表达CD44,阳性率为95.8％;MSCs体外DAPI标记率高,初始标记率达99.6％.免疫荧光显示,bFGF＋MSCs组DAPI阳性细胞数明显高于MSCs组[（325±106）/mm2比（186±67）/mm2,P＜0.05],联合组MSCs分布更为均匀;部分MSCs与心肌细胞共定位.结论 经冠状静脉逆行灌注bFGF能更有效地促进MSCs归巢至梗死心肌;同时,MSCs在心肌内的分布也更为均匀.     

冠状静脉逆行灌注碱性成纤维细胞生长因子的体内浓度梯度

背景：体外研究发现,碱性成纤维细胞生长因子浓度梯度能够促进干细胞的迁移和增殖。然而,采用冠状静脉逆行灌注途径能否建立在体碱性成纤维细胞生长因子浓度梯度尚不明确。 目的：评价冠状静脉逆行灌注实验方法的安全性,建立并检测冠状静脉与局部缺血心肌间的碱性成纤维细胞生长因子浓度梯度,探讨逆行灌注后碱性成纤维细胞生长因子浓度梯度存在的时间窗。 方法：开胸结扎法建立犬急性心肌梗死模型,1周后经冠状静脉逆行灌注碱性成纤维细胞生长因子。灌注结束后球囊充盈时间分别为0,5,10,15 min。解除球囊充盈后即刻处死动物,ELISA法测量血浆和梗死区心肌、梗死边缘区心肌组织匀浆中碱性成纤维细胞生长因子的浓度,在体评价在不同时间点冠状静脉血液与梗死区心肌以及梗死边缘区心肌之间的碱性成纤维细胞生长因子浓度梯度。 结果与结论：逆行灌注成功率为100%,无死亡、心脏压塞和恶性心律失常等并发症发生。灌注后5 min和10 min,冠状静脉血液与梗死区心肌之间碱性成纤维细胞生长因子浓度的差异有显著性意义,梗死区心肌浓度明显高于其他2种组织。球囊充盈15 min后2组之间浓度差异无显著性意义。结果表明,经冠状静脉逆行灌注碱性成纤维细胞生长因子后,球囊充盈的时间为5-10 min能在冠状静脉血液与梗死心肌之间建立稳定的碱性成纤维细胞生长因子浓度梯度,而且在梗死心肌区域浓度最高。此时间窗内灌注干细胞有望增强其移行活力。