Sigma E基因对耻垢分枝杆菌五种药物敏感性的影响及机制研究

目的 探讨Sigma E (sigma factor E,SigE)基因影响耻垢分枝杆菌对5种药物的敏感性及其作用机制研究。方法 PCR法扩增出耻垢分枝杆菌sigE基因,克隆入质粒pMV261构建重组pMV261-SigE质粒,测序验证。重组质粒电转入耻垢分枝杆菌,Western blot检测SigE的表达。设立含空质粒转化菌为对照组,采用刃天青作为指示剂的微量滴定板法和菌落计数法检测pMV261-SigE重组耻垢分枝杆菌对异烟肼、利福平、乙胺丁醇、左氧氟沙星和环丙沙星5种抗结核药物的敏感性。采用相应抗生素处理重组耻垢分枝杆菌48 h诱导细菌进入非复制持留状态,随后在含20 ng/mL的结核分枝杆菌复苏促进因子E (resuscitation-promoting factor E, RpfE)的7H9中静置培养2周,计数最大可能数和细菌生长数,测算复苏指数来了解SigE对药物敏感性的影响机制。结果 成功构建pMV261-SigE,经测序鉴定序列正确,Western blot检测到SigE在耻垢分枝杆菌中表达。与对照组相比,表达SigE重组耻垢分枝杆菌组对异烟肼、利福平等5种药物的相对荧光百分比高,敏感性下降。5组抗生素中,异烟肼、乙胺丁醇两种药物作用后pMV261-SigE重组耻垢分枝杆菌复苏指数明显高于对照组。结论 SigE可通过促进耻垢分枝杆菌进入持留状态影响异烟肼和乙胺丁醇作用的敏感性。     

锌离子依赖的金属蛋白酶-1体内抑制分枝杆菌的抗原处理

目的：在小鼠体内观察卡介苗的锌离子依赖的金属蛋白酶-1（Zinc metalloprotease-1,Zmp1）对结核分枝杆菌抗原PPE68处理的影响。方法：6～8周龄BALB/c小鼠随机分为5组,分别为pBudCE4.1空质粒对照组（n=7）、表达PPE68抗原肽的pBud－CE4.1-PPE68p质粒组（n=9）、表达PPE68抗原的pBudCE4.1-PPE68质粒组（n=9）、PPE68抗原和Zmp1共表达的pBudCE4.1-PPE68-Zmp1质粒组（n=10）及PPE68抗原肽和Zmp1共表达的pBudCE4.1-PPE68p-Zmp1质粒组（n=8）。各组质粒电转化减毒沙门菌株SL7207构建相应的重组沙门菌。以灌胃方式将各组沙门菌免疫小鼠3周。收集小鼠血液和肺肠灌洗液,采用ELISA法测定血清中IFN-γ、IL-12含量及肺与肠道sIgA的含量;分离培养脾细胞,用CCK-8法检测脾淋巴细胞增殖情况。结果：与PPE68抗原组相比,PPE68和Zmp1共表达组的IFN-γ（117.29±16.86,P=0.034）、IL-12（40.46±7.11,P=0.0037）、淋巴细胞刺激指数SI（3.30±0.49,P=0.004）均降低;与PPE68抗原肽组相比,PPE68抗原肽和Zmp1共表达组相应因子含量下降不明显,IFN-γ（132.75±28.40,P=0.070）、IL-12（55.43±11.78,P=0.198）、SI（4.70±1.57,P=0.124）。结论：卡介苗的Zmp1影响结核分枝杆菌抗原PPE68的处理过程,这可能是影响BCG免疫效果的重要原因。