Survivin启动子介导的胞嘧啶脱氨酶(CD)自杀基因的抗肿瘤研究

目的 探讨Survivin启动子介导的CD/5-FC自杀系统的抗肿瘤效果.方法 利用Survivin启动子替换pEGFP-N1载体上的巨细胞病毒(CMV)启动子,构建重组表达载体pSurP-EGFP,通过报告基因绿色荧光蛋白(GFP)的表达确定Survivin启动子的特异性;将酿酒酵母的胞嘧啶脱氨酶(CD)基因克隆在pSurP-EGFP中,构建成重组载体pSurP-CD,转染肿瘤细胞后利用毛细管电泳仪检测前药5-氟胞嘧啶(5-FC)的转化效率,同时分析肿瘤细胞的凋亡.结果 GFP的表达表明Survivin启动子具有较好的肿瘤靶向性;毛细管电泳检测表明CD能够有效地将5-FC转化为5-FU,显微镜观察和流式分析表明了Survivin启动子介导的CD的抗肿瘤效果.结论 Survivin启动子能有效地介导CD自杀基因的表达,具有较好的靶向性抗肿瘤效果.     

5型腺病毒载体对人T淋巴细胞的转染及细胞毒性分析

 目的:利用5型腺病毒载体转染人T淋巴细胞,对其转染T淋巴细胞的效率以及细胞毒性进行分析。方法:选取T淋巴瘤Jurkat细胞及原代T细胞,腺病毒按感染复数(multiplicity of infection, MOI)为20、50、100、200和400对其转染,转染48 h后利用流式细胞术检测转染效率;选取腺病毒转染后的不同时点,利用碘化丙啶染色法分析转染对于细胞周期的影响;利用Annexin V/7-AAD染色法分析转染诱导细胞凋亡情况;利用台盼蓝染色计数法分析转染对活细胞数目的影响。结果:5型腺病毒载体转染T淋巴瘤的效率最高,转染效率随着MOI值的增大而增加;CD8+ T细胞和CD4+ T细胞的转染效率大致相同,T细胞经刺激活化后,CD8+ T细胞的转染效率下降;病毒转染未导致明显细胞凋亡;病毒转染对细胞周期与活细胞数目没有显著影响。结论:5型腺病毒载体转染T细胞呈现较低细胞毒性。     

补血方协同转染TCRVβ7.1 PBMC对肿瘤化疗造成骨髓抑制的缓解机制

目的:探讨补血方协同转染TCRVβ7.1 PBMC对肿瘤化疗造成骨髓抑制的缓解机制.方法:采用体外细胞实验建立化疗损伤模型,利用MTT法测定肿瘤细胞的死亡率,利用ELISA法检测造血相关细胞因子的分泌情况.结果:与对照组相比补血方与转染TCRVβ7.1 PBMC组能够明显促进粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)的分泌,并且加PBMC组与单纯化疗药组相比能够明显抑制肿瘤的生长.结论:补血方协同转TCRVβ7.1 PBMC不仅能够对肿瘤细胞起到杀伤作用,且对化疗药所引起的骨髓抑制有一定的缓解作用.     

碱性成纤维细胞生长因子对生长板软骨细胞增殖与分化的影响

背景：体外培养软骨细胞经历多次传代后，其增殖能力将逐渐退化。实验表明，碱性成纤维细胞生长因子可促进软骨细胞增殖，并可能影响软骨细胞的表型与分化。目的：观察碱性成纤维细胞生长因子对生长板软骨细胞增殖和分化的影响，并筛选其用于体外软骨细胞培养的最佳剂量。设计、时间及地点：以细胞为观察对象的观察对比实验，于2004—10／2005—02在暨南大学医学院生化教研室组织工程实验室完成。材料：选用12只新西兰白兔用于分离软骨细胞，碱性成纤维细胞生长因子由英国PeproTech公司生产。方法：分离并在低血清条件下培养兔生长板软骨细胞。根据实验需要加入0，1，2．5，5，10，25，50及100μg／L8个剂量的碱性成纤维细胞生长因子，进行各项指标观察。主要观察指标：应用改良四甲基偶氮唑蓝比色法检测细胞增殖倍数；应用羟脯氨酸法测定软骨细胞胶原产量：应用酶动力学方法测定碱性磷酸酶活性。结果：①碱性成纤维细胞生长因子剂量在5～100μg／L范围内可以促进软骨细胞增殖，并以25μg／L时刺激效果最为显著。②当碱性成纤维细胞生长因子剂量高于25μg／L时，软骨细胞的胶原合成被抑制。③当碱性成纤维细胞生长因子剂量高于1ug／L时，软骨细胞的碱性磷酸酶活性被抑制。结论：碱性成纤维细胞生长因子可以刺激生长板软骨细胞增殖，并在剂量高于25μg／L时抑制生长板软骨细胞的分化。     

人类TCRαβ家族V基因的进化研究

目的：了解人类TCRα家族V基因（TCRAV）和TCRβ家族V基因（TCRBV）的进化特征。方法：采用MEGA3．1软件对人类TCRAV和TCRBV基因分别构建进化树，并估算基因复制的发生时间；采用FEL法检测TCRAV和TCRBV编码序列正选择和负选择位点。结果：进化树显示TCRAV和TCRBV的基因分组在进化过程中已经维持了相当长的时间。TCRAV已经不受正选择作用，TCRBV基因序列的CDR8区域检测到两个正选择位点。结论：人类TCRαβ家族V基因的进化特征为研究TCR基因在机体免疫及疾病防治提供了理论分析基础。     

青海地区胃癌相关性贫血的临床研究

目的：通过青海地区胃癌患者的贫血状况的分析,明确本地区贫血与胃癌分期及化疗效果的相关性。方法：收集2004年6月到2008年4月来院治疗的胃癌患者258例,检查血常规以了解贫血的状况,分析贫血发生率与肿瘤分期的关系。跟踪病例化疗情况,分析化疗后贫血发生率及其与预后间的关系。结果：样本中贫血发生率为43.8%。其中女性中为51.8%;男性中为41.6%,无显著性差异。在258例病人中具有完整TNM分期的195例,胃癌患者的贫血发生率根据肿瘤分化程度、肿瘤分期、浸润深度、淋巴结转移、远处转移、肿瘤大小、年龄不同有显著性差异。肿瘤在胃贲门区、胃体部、胃窦区贫血发生率无显著性差异。258例胃癌患者接受三周期化疗后,贫血病人为161例。其中化疗后出现贫血的病人有46例,疾病控制率（DCR）为78.26%,客观缓解率（ORR）为21.74%。而化疗后无贫血的17例病人,疾病控制率（DCR）94.12%,客观缓解率（ORR）为52.94%。贫血组和非贫血组的DCR和ORR有显著性差异。在化疗过程中,15例病人接受了输血治疗,没有关于铁剂及促红细胞生成素（Erythropoietin,EPO）治疗的记录。结论：按NCI标准判断,青海地区胃癌相关性贫血的发生率与国内其他地区发生率相近。胃癌相关性贫血的发生率与肿瘤分化程度、肿瘤分期、浸润深度、淋巴结转移、远处转移、肿瘤大小、年龄有关。化疗过程中发生贫血的病人对化疗的反应差,化疗过程中未发生贫血的病人疗效较好。本研究中贫血的发生率与患者性别及肿瘤的部位无关。     

Survivin-2B诱导人乳腺癌细胞凋亡的初步研究*

 目的：探讨存活蛋白2B (survivin-2B)在诱导肿瘤细胞凋亡中的分子机制。方法：将survivin-2B基因插入真核表达载体pCDNA3.1,得到重组载体pCDNA3.1-survivin-2B。将空载体pCDNA3.1及重组载体pCDNA3.1-survivin-2B分别转染人乳腺癌细胞株MCF7,转染后48 h,用annexin V/7-AAD染色法分析细胞凋亡情况,利用碘化丙啶染色法分析转染对细胞周期的影响;同时提取总RNA并反转录成cDNA,进行多重聚合酶链反应。利用GeXP多基因表达分析系统检测21个与肿瘤相关基因的表达情况。结果：过表达survivin-2B基因导致MCF7细胞凋亡与细胞周期阻滞,并引起8个基因表达上调,2个基因表达下调。变化最大的为醛脱氢酶4家族成员A1（ALDH4A1）,表达下降48%;变化最小的为胞质分裂调控蛋白1（PRC1）,上调1.08倍。结论：Survivin-2B能够诱导细胞凋亡与细胞周期G2/M期阻滞,并引起部分肿瘤相关基因的表达变化。     

肿瘤特异性TCRαβ基因转染诱导记忆性T细胞分化及其免疫功能的研究

目的研究特异性TCR基因转染T细胞被肿瘤抗原激活后,记忆性T细胞的分化情况,并明确其表型特征和免疫功能。方法密度梯度离心法分离PBMC,重组TCR腺病毒感染T细胞,流式细胞术检测外源TCR表达效率。AFP表位肽刺激T细胞,流式细胞术检测TCR基因转染T细胞经抗原刺激后,记忆性T细胞标志分子表达。MTT法检测T细胞对不同肿瘤细胞株的杀伤活性。Annexin V-PI双染法检测靶细胞凋亡比例。ELISA法检测T细胞作用于靶细胞后IFN-γ与IL-2分泌水平。结果重组腺病毒载体感染3 d后,外源TCR表达比例接近30%。特异性TCR基因转染可有效促进T细胞识别肿瘤抗原后活化,CD45RO+细胞比例逐渐上升至接近50%。CD45RO+细胞以CD62L–CD44+表型为主。此后CD62L+细胞比例逐渐上升。最终出现分群明显的CD62L+CD44+TCM表型细胞。特异性TCR基因转染能够促进T细胞杀伤AFP+靶细胞,诱导靶细胞凋亡,并促进IFN-γ分泌。抗原预先刺激能够进一步增强TCR基因转染T细胞抗肿瘤免疫效应。结论 TCR基因转染能够有效促进T细胞识别肿瘤抗原后活化。经肿瘤抗原预先刺激的TCR基因转染T细胞将启动记忆性T细胞分化,在再次遭遇表达相同抗原的肿瘤细胞时发挥更为强烈的免疫效应。     

Calcein-AM荧光扫描测定细胞毒方法的建立

目的：建立和优化基于钙黄绿素-AM（ Calcein-AM）荧光扫描的细胞毒测定方法。方法：首先使用Calcein-AM染色靶细胞,扫描检测Calcein-AM荧光值,确定Calcein-AM最佳激发波长和发射波长;然后优化Calcein-AM染色的浓度和时间;最后以效靶比为30∶1～1∶1,共孵育时间为4 h,荧光扫描测定靶细胞裂解的百分率。结果：荧光染料Calcein-AM能有效标记靶细胞,最佳激发波长和发射波长为485 nm和515 nm;Calcein-AM对细胞毒性低,不影响细胞活性;4 h内的自发释放率低于15％;CIK（ Cytokine induced killer ）效应细胞与靶细胞共孵育4 h的细胞毒效应随效靶比增加而升高。结论：建立和优化了Calcein-AM荧光染料标记靶细胞检测细胞毒效应的方法,该方法可避免放射性试剂的应用,对细胞毒性低,准确性高。     

青海地区胃癌相关性贫血的临床研究

目的:通过青海地区胃癌患者的贫血状况的分析,明确本地区贫血与胃癌分期及化疗效果的相关性。方法:收集2004年6月到2008年4月来院治疗的胃癌患者258例,检查血常规以了解贫血的状况,分析贫血发生率与肿瘤分期的关系。跟踪病例化疗情况,分析化疗后贫血发生率及其与预后间的关系。结果:样本中贫血发生率为43.8%。其中女性中为51.8%;男性中为41.6%,无显著性差异。在258例病人中具有完整TNM分期的195例,胃癌患者的贫血发生率根据肿瘤分化程度、肿瘤分期、浸润深度、淋巴结转移、远处转移、肿瘤大小、年龄不同有显著性差异。肿瘤在胃贲门区、胃体部、胃窦区贫血发生率无显著性差异。258例胃癌患者接受三周期化疗后,贫血病人为161例。其中化疗后出现贫血的病人有46例,疾病控制率(DCR)为78.26%,客观缓解率(ORR)为21.74%。而化疗后无贫血的17例病人,疾病控制率(DCR)94.12%,客观缓解率(ORR)为52.94%。贫血组和非贫血组的DCR和ORR有显著性差异。在化疗过程中,15例病人接受了输血治疗,没有关于铁剂及促红细胞生成素(Erythropoietin,EPO)治疗的记录。结论:按NCI标准判断,青海地区胃癌相关性贫血的发生率与国内其他地区发生率相近。胃癌相关性贫血的发生率与肿瘤分化程度、肿瘤分期、浸润深度、淋巴结转移、远处转移、肿瘤大小、年龄有关。化疗过程中发生贫血的病人对化疗的反应差,化疗过程中未发生贫血的病人疗效较好。本研究中贫血的发生率与患者性别及肿瘤的部位无关。