杭州市1 731株结核分枝杆菌耐药状况分析

目的 了解杭州市区县范围内耐药结核病的流行状况。方法 采用浓度比例法和PNB/TCH生长实验对2018年1月至2019年12月分离自杭州市周边7个县区的1 975份肺结核病人的培养菌株进行药物敏感性实验和菌种鉴定,并用统计学方法分析耐药谱和耐药率。结果 1 731株结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis,MTB)中, 18.26%(316/1 731)菌株至少对一种受试药物耐药,一线药物、二线药物、单耐药、多耐药、耐多药、广泛耐药、利福平耐药的耐药率分别是14.96%(259/1 731)、4.97%(86/1 731)、11.84%(205/1 731)、3.81%(66/1 731)、2.60%(45/1 731)、0.06%(1/1 731)、3.24%(56/1 731),共28种耐药谱。初治患者耐药率与复治患者耐药率差异无统计学意义(P>0.05)。比较2011年、2015年、2018-2019年这3个时间段,一线药物的总耐药率、初治患者耐药率、复治患者耐药率以及耐多药的总耐药率和复治耐药率均呈现下降趋势(均P<0.05)。二线药物OFX的总耐药率和初治患者耐药率较2015年升高(P<0.05)。60岁以上的结核病患者占比最大(47.95%)。7个区县的耐药率存在差异。结论 2011-2019年杭州市区县结核病定点医院收治的结核病人的耐药率逐年下降,目前采取的防控措施切实有效。今后要重点关注耐药率较高区县的耐药病人和40~60岁耐药病人的治疗和管控,加强老年人结核病的防控。     

快速检测结核分枝杆菌异烟肼和利福平耐药相关基因mPCR-SSCP建立及应用

目的 建立快速检测结核分枝杆菌异烟肼(INH)和利福平(RFP)耐药相关基因katG、inhA和rpoB突变的多重聚合酶链反应-单链构象多态性(multi PCR-single strand conformational polymorphism analysis,mPCR-SSCP)方法.方法 药敏试验检测134株结核分枝杆菌临床菌株对INH和RFP的耐药性.设计结核分枝杆菌INH和RFP耐药相关katG、inhA和rpoB基因PCR引物,建立mPCR-SSCP技术检测上述菌株katG、inhA和rpoB基因的突变,同时采用PCR直接测序技术(PCR-DS)检测上述基因片段突变情况,并对上述3种方法检测结果进行分析和比较.结果 134株临床菌株均含有katG、inhA和rpoB基因,其中42株(31.3％)对INH耐药、45株(33.6％)对RFP耐药.mPCR-SSCP和PCR-DS检测结果显示,92株INH敏感菌株katG和inhA基因均未发生突变,检测特异性均为100％;89株RFP敏感菌株中rpoB基因分别有2株和1株检测出突变,检测特异性分别为97.8％和98.9％;42株INH耐药菌株中分别有33株和36株katG和/或inhA基因突变,检测灵敏度分别为78.6％和85.7％;45株RFP耐药菌株中rpoB基因分别有41株和43株发生突变,检测灵敏度分别为91.1％和95.6％.结论 本研究建立的mPCR-SSCP能快速、简便、特异,并有一定的敏感性检测结核分枝杆菌异烟肼和利福平耐药相关基因katG、inhA和rpoB突变,具有临床应用前景.     

杭州地区流行非结核分枝杆菌鉴定、易感因素和耐药性分析

目的了解近年杭州地区非结核分枝杆菌(NTM)感染、优势菌种及其耐药性。方法采用PNB/TCH生长试验对1 972例患者分枝杆菌阳性培养物标本中NTM进行初步鉴定。采用分枝杆菌分子线性探针法和16SrRNA基因PCR产物测序鉴定NTM菌种。分析性别和年龄对NTM易感性的影响。采用浓度比例法检测NTM分离菌株对异烟肼(INH)、利福平(RFP)、链霉素(SM)、乙胺丁醇(EMB)、氧氟沙星(OFX)、卡那霉素(KM)的敏感性。结果 9.8%(193/1 972)分枝杆菌阳性培养物标本PNB/TCH生长试验结果阳性。分子线性探针法和16SrRNA基因PCR产物测序结果显示,193例PNB/TCH生长试验阳性标本中,66.3%为单一NTM、18.1%为2种分枝杆菌、8.3%为结核分枝杆菌、7.3%为非分枝杆菌属细菌感染。173株NTM(单一感染128株+混合感染45株)中,胞内分枝杆菌占57.8%,其次为脓肿分枝杆菌、堪萨斯分枝杆菌、龟分枝杆菌和鸟分枝杆菌(12.1%、9.8%、9.8%和5.8%)。35例分枝杆菌混合感染标本中,28.5%和20.0%分别为胞内分枝杆菌或龟分枝杆菌与结核分枝杆菌混合感染。NTM感染者男性多于女性(1.67∶1),50岁以上人群感染率(80.4%)高于50岁以下人群(P0.01),肺部感染比例(95.1%)远高于其他部位(P0.01)。NTM分离株对INH耐药率为100%,对其他5种抗结核药物的耐药率也高达70.3%~90.6%。结论胞内分枝杆菌是杭州地区近年优势流行的NTM菌种,NTM主要引起肺部感染且中老年人易感,NTM临床菌株对常用抗结核药物有很高的耐药性。     

细菌药物钝化酶基因分布及其表达诱导与抑制机制的研究

目的：了解临床常见病原菌药物钝化酶基因及其优势基因携带模式,抗生素诱导药物钝化酶基因表达上调的作 用及其与细菌组氨酸激酶的关系。 方法：采用PCR和测序法,了解金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌、鲍曼不动杆菌、阴沟肠杆菌临床菌株携带的β-内酰胺类、氨基糖苷类、大环内酯类钝化酶基因。采用实时荧光定量RT-PCR,了解抗生素诱导及组氨酸激酶阻断剂氯氰碘柳胺抑制药物钝化酶基因表达的作用。 结果：63株大肠埃希菌中检出4种β-内酰胺类、2种氨基糖苷类和1种大环内酯类钝化酶基因,优势基因携带模式为[TEM＋CTX-M]＋aac(3)-Ⅱ＋mphA 16株（25.4%）和[TEM＋CTX-M]＋aac(6′)-Ⅰb 13株（20.6%）。24株金黄色葡 萄球菌中检出2种β-内酰胺类、3种氨基糖苷类钝化酶基因,优势基因携带模式为aph(3′)（41.7%）或aac(6)-Ⅰe- aph(2)-Ⅰa（25.0%）。28株肺炎克雷伯菌中检出4种β-内酰胺酶、2种氨基糖苷类钝化酶基因,优势基因携带模式为 [TEM＋SHV]＋[aac(6′)-Ⅰb＋aac(3)-Ⅱ]（28.6%）和[TEM＋SHV]＋[aac(6′)-Ⅰb＋aac(3)-Ⅱ]＋mph（17.8%）。鲍曼不动杆菌和阴沟肠杆菌也以携带两类或三类药物钝化酶基因为优势模式。1/4 MIC青霉素、头胞噻肟和链霉素,能诱导3种β-内酰胺类和4种氨基糖苷类钝化酶基因表达显著上调（P<0.05）,该诱导作用可被氯氰碘柳胺 所抑制（P<0.05）。 结论：上述临床常见病原菌多携带多类药物钝化酶基因并存在不同的优势基因携带模式。低浓度抗生素可能诱导药物钝化酶基因表达上调,但可被组氨酸激酶阻断剂所抑制。     

杭州市儿童猩红热病原学及其相关血链球菌毒力基因分析

目的 了解杭州市儿童猩红热患者的病原学特征,分析猩红热相关血链球菌毒力基因分布。方法 采集杭州市儿童医院2016年4月至2018年6月32例猩红热患者咽拭子以及杭州市某幼儿园215份健康儿童咽拭子,分离培养,鉴定菌种,PCR检测化脓链球菌的emm基因,并进行分型。扩增分离自猩红热患者的缓症链球菌群血链球菌S28的毒力基因。结果 从猩红热患者咽拭子分离链球菌22株,其中GAS占31.82%(7/22),缓症链球菌群占68.18%(15/22)。从健康儿童咽拭子分离链球菌36株,GAS占11.11%(4/36),缓症链球菌群占88.89%(32/36)。从S28中克隆到lmb、tig、gapA、psaA、fbp54、mf2共6个毒力基因,均为化脓链球菌的毒力基因。结论 杭州市临床诊断的儿童猩红热21.88%(7/32)是由化脓链球菌引起,46.88%(15/32)是由缓症链球菌群引起的猩红热样病症,从这些患者分离的血链球菌中发现了与化脓链球菌致病有关的毒力基因。     

应用列线图模型量化评估耐多药结核病的发病风险

目的:构建一个简单、精准和个体化的列线图模型,并评估该模型预测有结核病史人群的耐多药结核病发病风险的应用价值。方法:采用1∶2匹配的病例对照研究方法,纳入2005年1月1日至2019年12月31日于杭州市12家结核病定点医院结束肺结核治疗的1 881例有结核病史的患者,其中训练数据集1 719例,外部验证数据集162例...     

肺结核病原体和易感因素及结核分枝杆菌优势耐药谱分析

目的 了解县镇地区肺结核流行现状及其易感因素、结核分枝杆菌耐药谱和优势耐药组合模式方法 采用罗氏培养基和PNB/TCH生长试验,对杭州市周边7个县镇临床诊断为肺结核的2 840例初治和712例复治患者抗酸染色阳性痰标本进行分枝杆菌分离培养和菌种鉴定。采用浓度比例法,检测3 152株结核分枝杆菌对链霉素(SM)、异烟肼(INH)、利福平(RIF)、乙胺丁醇(EMB)、氧氟沙星(OFX)和卡那霉素(KM)的敏感性。采用统计学方法分析结核分枝杆菌优势耐药模式以及肺结核易感因素结果 3 552株分枝杆菌中,88.7%(3 152/3 552)为结核分枝杆菌,11.3%(400/3 552)为非结核分枝杆菌,复治患者非结核分枝杆菌感染率(23.7%)显著高于初治患者(8.1%)(χ²=138.67,P<0.05)。3 152株结核分枝杆菌对6种抗结核药物总耐药率为25.1%,对一线抗结核药物耐药、耐多药和广泛耐药率分别为15.9%、4.6%和0.2%,其中SM(χ²=50.40, P<0.05)和INH耐药率较高(χ²=47.81, P<0.05)。结核分枝杆菌有35种耐药谱,优势耐药组合模式分别为INH+SM(χ²=19.19,P<0.05)、INH+RFP+SM(χ²=24.85,P<0.05)和IHN+RFP+SM+EMB(χ²=20.11,P<0.05)。来自复治患者的结核分枝杆菌总耐药、一线抗结核药物耐药、耐多药和广泛耐药率(38.3%、36.1%、14.0%和0.9%)均显著高于初治患者(22.3%、19.3%、2.7%和0.04%)(P<0.05)。本地户籍60岁以上男性农民肺结核发病率显著较高(χ²=1 435.29,P<0.05)结论 本县镇地区肺结核疫情防控形势依然严峻,老年男性农民是肺结核易感人群,复治肺结核患者非结核分枝杆菌感染率以及结核分枝杆菌耐药性显著高于初治肺结核患者,提示县镇地区肺结核患者抗结核药物规范化治疗有待加强。     

1株分离自猩红热患儿的耐多药嵴链球菌全基因组测序及比较基因组分析

目的 研究杭州地区1株分离自猩红热患儿咽拭子的耐多药嵴链球菌(Streptococcus cristatus, S.cristatus)S22的致病、耐药机理,基因组水平与其他嵴链球菌的进化关系以及与猩红热的潜在联系。方法 对S22进行高通量测序,分析基因组基本特征、毒力基因和耐药基因。联合NCBI基因组数据库中相关链球菌的基因组,分析平均核苷酸相似度(ANI)和构建全基因组SNPs进化树,分析嵴链球菌的进化关系。结果 菌株S22基因组全长2.041 84 Mb,有1 980个CDS,平均GC含量42.7%。S22含有33个毒力基因,是条件致病菌,与猩红热致病菌化脓链球菌毒力基因分布差异很大,从基因组角度没有直接证据显示S22与猩红热的关系。S22含有3个耐药基因ermB、tetM、bacA,与耐药表型一致。其中ermB,tetM位于类Tn6002的转座子上。比较基因组学显示S22在进化上亲缘关系最近的是分离自中国的3株嵴链球菌AS 1.3089,NBRC106105,NCTC13807,在这4株菌上均发现了类Tn6002转座子。此外,基因序列分析的结果提示嵴链球菌771_SOLI和嵴链球菌787_SOLI应归为格氏链球菌(Streptococcus gordonii,S.gordonii),嵴链球菌550_SOLI应归为血链球菌(Streptococcus gordonii,S.sanguinis)。结论 条件致病菌S22不直接引起猩红热,但S22寄居在咽部,并耐大环内酯类抗生素,在使用大环内酯类抗生素后,S22有可能成为咽部的优势菌群,引起菌群失调甚至致病。有4株已测序的嵴链球菌中发现耐大环内酯类和四环素的转座子,均分离自中国,提示我们要控制抗生素尤其是大环内酯类抗生素的使用。     

耐多药肺结核患者治疗6个月末痰培养阴转的影响因素分析

目的 了解耐多药肺结核(MDR-PTB)患者治疗6个月末痰培养阴转情况及其影响因素。方法 采用回顾性队列研究的方法,收集2011—2015年杭州市结核病定点医院确诊并开始抗结核药物治疗的365例MDR-PTB患者的人口学信息和实验室检测结果资料,分析研究对象治疗6个月末痰培养阴转情况,并采用Cox比例风险回归模型分析影响研究对象治疗6个月末痰培养阴转的因素。结果 365例研究对象中,332例在治疗6个月末痰培养阴性,阴转率为90.96%;287例(78.63%)治疗成功,78例(21.37%)治疗未成功。332例痰培养阴转的研究对象,阴转时间中位数(四分位数)为85.0(42.0,106.5)d,其中,治疗成功者占84.94%(282例)。33例痰培养未阴转者中,治疗成功者占15.15%(5例),两组比较差异有统计学意义(χ ²=87.00,P=0.000)。Cox回归分析结果显示,杭州户籍的MDR-PTB患者治疗6个月末痰培养易阴转[阴转率为4.09/100人年(149/36.41);调整风险比(aHR)(95%CI):1.37(1.10~1.71)];而对抗结核药物耐药的药品数量(简称“耐药数”)≥4种[阴转率为3.36/100人年(119/35.43);aHR(95%CI):0.76(0.61~0.96)]和年龄≥25岁[25~44岁组阴转率为3.69/100人年(143/38.80);aHR(95%CI):0.56(0.41~0.78)。45~64岁组阴转率为3.36/100人年(108/32.15);aHR(95%CI):0.52(0.37~0.73)。≥65岁组阴转率为3.33/100人年(27/8.10);aHR(95%CI):0.45(0.38~0.72)]的MDR-PTB患者治疗6个月末痰培养不易阴转。 结论 杭州地区MDR-PTB患者治疗成功率及治疗6个月末痰培养阴转率较高,但治疗6个月末痰培养阴转所需时间较长,应针对非杭州户籍者、耐药数多和年龄大的患者早期加强治疗和督导管理,以提高患者的治疗效果。     

浙江地区耐多药结核分枝杆菌基因突变特征分析

目的 分析浙江地区耐多药结核分枝杆菌(M.tuberculosis complex,MTBC)异烟肼(isoniazid,INH)和利福平(rifampicin,RIF)耐药相关基因突变特征.方法 对患者痰标本阳性培养物进行菌种鉴定,提取耐多药菌株DNA,应用PCR法对inhA、katG和rpoB RRDR区进行扩增,...