肿瘤靶向性细胞穿膜肽的固相合成及体外活性研究

目的采用固相合成法合成以基质金属蛋白酶为靶点的肿瘤靶向性细胞穿膜肽,用5-羧基四甲基罗丹明对其进行荧光标记,并对合成的产物进行生物活性和细胞毒性评估。方法采用N-芴甲氧羰基(Fmoc)作为α-氨基酸的保护基,以逐个延伸的固相合成法合成肿瘤靶向性细胞穿膜肽,并在有耦合剂HATU和DMF的情况下,加入5-羧基四甲基罗丹明进行荧光标记,应用高效液相色谱分析仪和质谱仪测定其纯度和分子量;荧光显微镜观察穿膜肽对体外培养的肝癌细胞株SMMC-7721和正常肝脏细胞株LO2的穿膜效果,以评价穿膜肽的生物学活性;MTT比色法检测穿膜肽对SMMC-7721细胞活性的影响。结果所合成的细胞穿膜肽经高效液相色谱法鉴定纯度为96.05%,经质谱鉴定相对分子量为3504.9。这种穿膜肽对正常肝脏细胞株LO2无明显穿膜作用,但对肝癌细胞株SMMC-7721有较强的穿膜作用,并且对细胞活性无明显影响。结论采用Fmoc固相肽合成法成功合成细胞穿膜肽;所合成的细胞穿膜肽具有肿瘤靶向性。     

5/35嵌合型溶瘤腺病毒SG635对肝癌细胞的抑制作用

目的:研究5/35嵌合型溶瘤腺病毒SG635在体外对肝癌HepG2和SMMC-7721细胞的特异性杀伤作用。方法:将SG600载体中5型腺病毒(Ad5)纤毛蛋白的knob和shaft结构域替换为35型腺病毒(Ad35)纤毛蛋白的相应结构域,构建成5/35嵌合型溶瘤腺病毒SG635。流式细胞术检测5/35嵌合型腺病毒Ad5/35-EGFP对HepG2和SMMC-7721细胞的感染效率,体外病毒增殖实验观察溶瘤腺病毒SG635的增殖能力,Western blotting检测SG635感染后肝癌细胞中E1A蛋白的表达,CCK-8实验检测SG635对肝癌HepG2和SMMC-7721细胞的杀伤作用。结果:在肝癌HepG2和SMMC-7721细胞中,Ad5/35-EGFP的感染效率明显强于5型腺病毒Ad5-EGFP;5/35嵌合型溶瘤腺病毒SG635在HepG2和SMMC-7721细胞中72 h的增殖倍数高于5型溶瘤腺病毒SG600(15 848.93vs6 309.57,6 309.57vs5 011.87,均P<0.01),而在人正常成纤维细胞BJ中几乎不增殖。SG635感染后,HepG2和SMMC-7721细胞中E1A蛋白表达高于SG600感染,在BJ中则无E1A表达。在一定MOI范围内,SG635对于HepG2细胞和SMMC-7721细胞的杀伤作用逐渐增强,且杀伤率明显强于SG600(MOI为1时,90%vs60%;MOI为10时,90%vs50%),对BJ无杀伤作用。结论:5/35嵌合型溶瘤腺病毒SG635能够高效感染并特异性杀伤肝癌细胞,具有较好的靶向性和安全性。     

高敏与普通荧光定量PCR技术在不同病毒载量慢乙肝患者HBV-DNA检测的一致性及应用价值

目的 比较高灵敏度与普通荧光定量聚合酶链式反应(qRT-PCR)法对乙型肝炎病毒DNA(HBV-DNA)定量检测结果的相关性与一致性。方法 收集2020年8月-2021年6月中山大学附属第三医院感染性疾病科门诊患者的血浆标本511份。以Bland-Altman图分析2种检测方法间绝对与相对偏差,以组内相关系数(ICC)评价方法间一致性。高敏法HBV-DNA检出率与临床指标的关系用χ²检验分析。结果 在收集的511份慢性乙型肝炎(CHB)患者样本中,高灵敏度与普通荧光定量PCR法在<2×103、2×103～<2×106和2×106～IU/mL组的ICC分别为0.54、0.80和0.66,差异有统计学意义(P<0.05)。Bland-Altman法也显示类似的结果。对于HBV-DNA低于检测下限(普通PCR法)的样本,乙型肝炎表面抗原(HBsAg)≥1 000 IU/mL、丙氨酸氨基转移酶(ALT)异常和未治疗的高灵敏度法检出率显著高于HBsAg<1 000 IU/mL、ALT正常和抗病毒治疗(χ²=6.67、5.00、3...     

Fibulin-1蛋白的真核表达与ELISA检测方法的建立

目的建立检测血清中Fibulin-1蛋白浓度的ELISA方法。方法构建Fibulin-1蛋白真核表达载体,以人Fibulin-1基因编码序列为模板,将目的片段定向克隆入载体并转入毕赤酵母菌,进行Fibulin-1蛋白的真核表达。表达产物纯化后,Westernblotting检测证明纯化的重组蛋白的抗原特异性。以该蛋白为定标绘制标准曲线,建立人血清ELISA检测方法并检测其精密度和回收率,最后初步分析人血清中Fibulin-1的含量。结果从真核表达体系获得了纯化的Fibulin-1蛋白,其具有良好的抗原特异性;建立的ELISA方法线性相关系数W=0．98,线性范围为12．5—800ng／mL,检测灵敏度为6．25ng／mL,蛋白回收率在94．33％～109．33％之间,CV均〈10％,具有良好的重复性;检测30例正常人血清样本中Fibulin-1的含量约为（31±8）μg／mL。结论建立的ELISA方法可用于检测血清中的Fibulin-1蛋白含量。     

HGF与CTLA-4Ig双基因修饰增强脐带间充质干细胞的免疫抑制和促增殖作用

【目的】探讨人脐带间充质干细胞(hUCMSC)经肝细胞生长因子(HGF)和细胞毒性T细胞相关抗原4免疫球蛋白(CTLA4-Ig)双基因修饰后免疫调节能力的变化及其促进肝细胞增殖作用的影响。【方法】酶联合消化法提取并鉴定人脐带间充质干细胞;对照组的hUCMSC转染携带绿色荧光蛋白(EGFP)基因的Ad5-EGFP,实验组的hUCMSC转染携带HGF和CTLA-Ig双基因的腺病毒Ad5-HGF/CTLA-4Ig。流式细胞仪检测对照组hUCMSC转染Ad5-EGFP后72 h表达EGFP细胞比率;实验组Ad5-HGF/CTLA-4Ig转染hUCMSC 72 h后,CCK8检测细胞存活率,同时再次检测hUCMSC免疫表型和向成骨细胞分化的能力,ELISA检测细胞上清中HGF含量,Western blot检测细胞中CTLA4-Ig蛋白的表达水平,通过CCK8法检测双基因修饰后hUCMSC对淋巴细胞增殖的影响及其上清对L02细胞增殖的影响。【结果】携带外源基因的腺病毒可有效转染hUCMSC,不影响其干细胞特性和多向分化能力,经HGF/CTLA-4Ig基因修饰hUCMSC可分泌高浓度HGF并高表达CTLA-4Ig,同时能有效地抑制淋巴细胞增殖,其上清能明显促进肝细胞增殖。【结论】hUCMSC经HGF/CTLA-4Ig基因修饰后生物学特性无明显改变,并能高表达HGF和CTLA-4Ig,其免疫调节及促进肝细胞增殖的能力进一步加强,为肝移植术后存在的肝细胞损伤的保护治疗提供了新思路。