日本血吸虫HGPRT重组抗原与不同佐剂联合应用对小鼠免疫保护作用的研究

目的:观察日本血吸虫(大陆株)次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(hypoxanthine-guanine phosphoribosyl-transferase, HGPRT)重组抗原(reSjc HGPRT)与ISA206或弗氏佐剂联合免疫对小鼠诱导抗日本血吸虫感染的保护作用. 方法:雌性C57BL/6小鼠随机分为5组:reSjc HGPRT加ISA206佐剂免疫组、reSjc HGPRT加弗氏佐剂组、ISA206佐剂对照组、弗氏佐剂对照组和感染对照组.20 μg重组抗原和ISA206或弗氏佐剂乳化后小鼠项背部多点皮下注射,共免疫3次,每次间隔2周.佐剂对照组小鼠仅注射ISA206或弗氏佐剂和生理盐水,感染对照组不注射任何重组抗原或生理盐水.于末次免疫后3周,每只小鼠经腹部皮肤感染(30±1)条日本血吸虫尾蚴,6周后剖杀小鼠,门脉灌注收集成虫,计数成虫数、雌雄合抱数和小鼠肝组织虫卵数.在免疫前、攻击感染前和小鼠剖杀前分别采血并分离血清,用ELISA检测血清中特异性IgG抗体. 结果:重组抗原加ISA206佐剂或弗氏佐剂免疫组均诱导小鼠产生特异性IgG抗体应答,与感染对照组和弗氏佐剂对照组相比,差异有统计学意义(P<0.05);诱导小鼠产生的减虫率、减雌雄合抱率和肝组织减卵率分别为53.7%、59.3%、44.9%和43.3%、44.1%、33.0%,与感染对照组和2种佐剂对照组相比均有统计学意义(P<0.05).结论:reSjc HGPRT与ISA206或弗氏佐剂联合免疫,可诱导小鼠产生抗血吸虫感染保护作用.     

环介导等温扩增技术检测牛源隐孢子虫的研究

目的 用环介导等温扩增技术检测牛源隐孢子虫.方法 提取牛粪中隐孢子虫卵囊DNA.根据隐孢子虫18S rRNA序列及环介导等温扩增(100p-mediated isothermal amplification,LAMP)技术的原理,设计4条隐孢子虫特异引物,利用LAMP检测牛粪中隐孢子虫卵囊DNA和蓝氏贾第鞭毛虫DNA,以正常牛粪DNA为阴性对照.LAMP产物经SYBR Green I显色及电泳后观察结果,绿色判为阳性,棕色判为阴性,对LAMP产物进行电泳分析,观察其特征条带的情况.结果隐孢子虫卵囊DNA检测管经显色后时不再呈绿色,阴性对照及蓝氏贾第鞭毛虫DNA呈棕色.隐孢子虫LAMP产物经电泳后呈LAMP特征性梯状条带,阴性对照及蓝氏贾第鞭毛虫DNA无扩增产物.结论 LAMP方法敏感、特异、简便,可用于检测牛粪中的隐孢子虫.     

日本血吸虫HGPRT编码基因的克隆与表达

目的 克隆和表达日本血吸虫大陆株次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(HGPRT)编码基因。方法依据GenBank日本血吸虫HGPRT开放阅读框(ORF)设计一对引物，上游和下游引物分别引入BamH I和Sal I酶切位点。以日本血吸虫大陆株（安徽株，简称Sjc-A）成虫总RNA为模板，反转录PCR (RT-PCR)扩增日本血吸虫大陆株HGPRT(SjcHGPRT)全长编码基因。经双酶切纯化的PCR产物与同样双酶切纯化的pET28a质粒DNA片段用T4 DNA连接酶连接，构建重组质粒pET28a-SjcHGPRT，转化感受态E．coli BL21，并大量扩增。重组质粒DNA经限制性内切酶双酶切、PCR、琼脂糖凝胶电泳和核苷酸序列测定进行鉴定。pET28a-SjcHGPRT/E．coli BL21I程菌用IPTG诱导表达，重组蛋白用SDS-PAGE和Western blot分析。结果 SjcHGPRT编码基因RT-PCR产物约700 bp，构建的pET28a-SjcHGPRT重组质粒DNA经限制性内切酶双酶切和PCR扩增产物于琼脂糖凝胶电泳均观察到相同大小的基因片段，根据核苷酸序列测序结果推导的氨基酸序列与报道的日本血吸虫大陆株（湖南株，简称Sjc-H）及曼氏血吸虫HGPRT分别有99%和83%的同源性。获得的重组蛋白(reSjcHGPRT)经SDS-PAGE和Western blot分析，分子量约30 kDa，并能被抗His-G-HRP抗体、日本血吸虫感染小鼠血清和日本血吸虫病人血清识别。结论 日本血吸虫大陆株(安徽株)HGPRT表达获得成功，并获得了纯化重组蛋白，为开展该分子功能和免疫原性研究奠定了基础。     

环介导等温扩增技术检测牛源隐孢子虫的研究

目的 用环介导等温扩增技术检测牛源隐孢子虫.方法 提取牛粪中隐孢子虫卵囊DNA.根据隐孢子虫18S rRNA序列及环介导等温扩增(100p-mediated isothermal amplification,LAMP)技术的原理,设计4条隐孢子虫特异引物,利用LAMP检测牛粪中隐孢子虫卵囊DNA和蓝氏贾第鞭毛虫DNA,以正常牛粪DNA为阴性对照.LAMP产物经SYBR Green I显色及电泳后观察结果,绿色判为阳性,棕色判为阴性,对LAMP产物进行电泳分析,观察其特征条带的情况.结果隐孢子虫卵囊DNA检测管经显色后时不再呈绿色,阴性对照及蓝氏贾第鞭毛虫DNA呈棕色.隐孢子虫LAMP产物经电泳后呈LAMP特征性梯状条带,阴性对照及蓝氏贾第鞭毛虫DNA无扩增产物.结论 LAMP方法敏感、特异、简便,可用于检测牛粪中的隐孢子虫.     

比氏肠细胞内原虫

比氏肠细胞内原虫,也称为比氏肠细胞内微孢子虫,是微孢子虫的一个种,可引起人类顽固性腹泻。其对人体的致病作用在近十多年来才逐渐引起人们的关注,所致疾病被列入新发传染病。该文从比氏肠细胞内原虫的分类、形态和生活史、临床表现、流行病学、实验诊断及防治等方面进行综述。     

日本血吸虫DNA鸡尾酒疫苗免疫研究

目的 研究日本血吸虫DNA鸡尾酒疫苗的免疫保护效果. 方法 制备日本血吸虫谷胱甘肽S-转移酶(glutathione S-transferase,GST)、硫氧还蛋白(thioredoxins, Trx)、次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(hypoxanthine-guanine phosphoriboribosyl-transferase,HGPRT)DNA疫苗,免疫C57BL/6小鼠.C57BE/6小鼠随机分为感染对照组、空质粒对照组、pVAX1-GST免疫组、pVAX1-Trx免疫组、pVAX1-HGPRT免疫组及DNA鸡尾酒疫苗组,依次注射生理盐水,空质粒pVAX1,pVAX1-GST,pVAX1-Trx,pVAX1-HGPRT和由pVAX1-GST、pVAX1-Trx、pVAX1-HGPRT等3种质粒混合而成的DNA鸡尾酒疫苗.每组小鼠于0、2、4周经股四头肌注射免疫,每次间隔2周.末次免疫后2周,每只小鼠经腹部皮肤感染30±1条日本血吸虫尾蚴.感染后42 d剖杀小鼠,并计数各组小鼠血吸虫成虫数和肝虫卵数. 结果 pVAX1-GST、pVAX1-Trx、pVAX1-HGPRT和DNA鸡尾酒疫苗免疫组小鼠的减虫率依次为0、35.78%、47.89%和48.13%,肝减卵率依次为22.94%、34.14%、43.35%和26.77%. 结论 pVAX1-Trx、pVAX1-HGPRT及DNA鸡尾酒疫苗具有一定的抗日本血吸虫病作用,但3种疫苗联合使用并未发现有显著的协同作用.     

微小隐孢子虫卵囊DNA提取及用于PCR检测

目的采用3种方法提取微小隐孢子虫卵囊DNA,并用于PCR检测以进行比较。方法 微小隐孢子虫卵囊经多次冻融加热破壁后,采用螯合树脂(Chelex-100)、酚/氯仿和基因组DNA纯化系统试剂盒3种方法提取微小隐孢子虫卵囊DNA,并根据微小隐孢子虫基因序列(L16996)设计一对寡核苷酸引物,分别对3种方法制备模板进行PCR扩增分析。Chelex-100提取的DNA也用于观察PCR检测的敏感性。结果3种方法制备的微小隐孢子虫卵囊模板用于PCR检测均获得1条446 bp条带,Chelex-100提取的DNA用于PCR检测的敏感性至少达0.5个卵囊。结论3种方法提取的微小隐孢子虫卵囊DNA均可用于PCR检测,Chelex-100法是一种高效而快速的微量提取DNA方法,适用于对隐孢子虫DNA的检测。     

安氏隐孢子虫热休克蛋白编码基因的克隆、表达和分析

目的 克隆、表达和分析安氏隐孢子虫Mr 70 000热休克蛋白（CaHSP70） 的部分编码基因。 方法 依据公布的CaHSP70基因序列设计引物，以江苏徐州安氏隐孢子虫（XZ-BOV）总RNA为模板，反转录PCR（RT-PCR）扩增目的编码基因。PCR产物经TA克隆后，亚克隆入pET28a原核表达载体，构建重组质粒pET28a-CaHSP70，转化感受态大肠埃希菌BL21（DE3），异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）诱导表达并获得纯化的重组蛋白（简称为rCaHSP70）。用十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）、蛋白质印迹（Western blotting）和ELISA对该重组蛋白进行分析和鉴定。采用相关生物信息学软件对序列进行分析。 结果 根据克隆的目的基因序列推导的氨基酸序列与GenBank登录的CaHSP70一致。SDS-PAGE和Western blotting分析显示，重组蛋白（rCaHSP70） Mr约为43 000（含6个组氨酸），以包涵体的形式存在，可被辣根过氧化物酶标记的抗组氨酸抗体、安氏隐孢子虫感染的小鼠血清、微小隐孢子虫感染的儿童血清和rCaHSP70免疫小鼠血清识别。rCaHSP70存在多个功能位点和潜在的抗原决定簇。种系发生分析表明XZ-BOV与安氏隐孢子虫进化关系最近。ELISA检测结果表明，rCaHSP70免疫的C57BL/6小鼠与BALB/c小鼠血清特异性抗体滴度均显著高于免疫前。 结论 XZ-BOV HSP70部分编码基因的克隆获得成功，研究获得的重组蛋白具有一定的免疫原性和免疫反应性。     

环介导等温扩增技术检测牛源隐孢子虫的研究

目的 用环介导等温扩增技术检测牛源隐孢子虫.方法 提取牛粪中隐孢子虫卵囊DNA.根据隐孢子虫18S rRNA序列及环介导等温扩增(100p-mediated isothermal amplification,LAMP)技术的原理,设计4条隐孢子虫特异引物,利用LAMP检测牛粪中隐孢子虫卵囊DNA和蓝氏贾第鞭毛虫DNA,以正常牛粪DNA为阴性对照.LAMP产物经SYBR Green I显色及电泳后观察结果,绿色判为阳性,棕色判为阴性,对LAMP产物进行电泳分析,观察其特征条带的情况.结果隐孢子虫卵囊DNA检测管经显色后时不再呈绿色,阴性对照及蓝氏贾第鞭毛虫DNA呈棕色.隐孢子虫LAMP产物经电泳后呈LAMP特征性梯状条带,阴性对照及蓝氏贾第鞭毛虫DNA无扩增产物.结论 LAMP方法敏感、特异、简便,可用于检测牛粪中的隐孢子虫.     

日本血吸虫DNA鸡尾酒疫苗免疫研究

目的 研究日本血吸虫DNA鸡尾酒疫苗的免疫保护效果. 方法 制备日本血吸虫谷胱甘肽S-转移酶(glutathione S-transferase,GST)、硫氧还蛋白(thioredoxins, Trx)、次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(hypoxanthine-guanine phosphoriboribosyl-transferase,HGPRT)DNA疫苗,免疫C57BL/6小鼠.C57BE/6小鼠随机分为感染对照组、空质粒对照组、pVAX1-GST免疫组、pVAX1-Trx免疫组、pVAX1-HGPRT免疫组及DNA鸡尾酒疫苗组,依次注射生理盐水,空质粒pVAX1,pVAX1-GST,pVAX1-Trx,pVAX1-HGPRT和由pVAX1-GST、pVAX1-Trx、pVAX1-HGPRT等3种质粒混合而成的DNA鸡尾酒疫苗.每组小鼠于0、2、4周经股四头肌注射免疫,每次间隔2周.末次免疫后2周,每只小鼠经腹部皮肤感染30±1条日本血吸虫尾蚴.感染后42 d剖杀小鼠,并计数各组小鼠血吸虫成虫数和肝虫卵数. 结果 pVAX1-GST、pVAX1-Trx、pVAX1-HGPRT和DNA鸡尾酒疫苗免疫组小鼠的减虫率依次为0、35.78%、47.89%和48.13%,肝减卵率依次为22.94%、34.14%、43.35%和26.77%. 结论 pVAX1-Trx、pVAX1-HGPRT及DNA鸡尾酒疫苗具有一定的抗日本血吸虫病作用,但3种疫苗联合使用并未发现有显著的协同作用.