大鼠骨髓间充质干细胞在静电纺丝素/聚乳酸纳米纤维上的培养及成神经诱导

目的通过将骨髓间充质干细胞（BMSCs）培养在静电纺丝素/聚乳酸纳米纤维上,研究BMSCs的生长及成神经分化情况。方法用家蚕丝素、柞蚕丝素分别与聚乳酸共混制成静电纺丝素/聚乳酸纳米纤维,将第5代大鼠BMSCs培养其上,于24h后通过活细胞工作站观察细胞的黏附情况,并进行表型鉴定及存活检测。接种后待细胞长至60%左右,用bFGF/BHA诱导细胞成神经分化,并设多聚赖氨酸组进行对照。在诱导5h和维持48h时,观察细胞的形态学改变,通过免疫荧光法鉴定神经细胞特异性标志物Nestin,β-Ⅲ-Tubulin和NCAM的表达并进行定量统计分析。结果BMSCs在静电纺丝素/聚乳酸纳米纤维上的黏附情况良好,细胞生长于纳米纤维上。存活检测中几乎未发现死细胞,多数细胞在材料上可存活。神经分化的形态学改变与多聚赖氨酸组一致,并且培养在纳米纤维上的细胞分化时出现的突起可缠绕在纺丝纤维上。神经特异标志的表达情况与多聚赖氨酸对照组的差异无统计学意义（P〉0.05）。结论静电纺丝素/聚乳酸纳米纤维具有良好的生物相容性,可支持BMSCs的黏附及成神经分化,且对细胞生存无毒性。     

全骨髓法分离培养骨髓间充质干细胞及向神经样细胞分化的研究

目的目前尚缺乏标准的骨髓间充质干细胞（BMSCs）的分离方法,实验通过全骨髓培养法分离纯化骨髓间充质干细胞,并诱导分化为神经样细胞,以寻找一种简便、实用的分离方法。方法取大鼠骨髓,全骨髓培养法结合差速贴壁法分离纯化大鼠骨髓间充质干细胞,传代扩增。倒置相差显微镜下观察骨髓间充质干细胞形态及生物学特点,免疫组化染色鉴定细胞。用MTT法间接测定不同代数细胞活力。诱导分化,先用碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）预诱导24h,然后加入丁羟基茴香醚诱导（BHA）和二甲基亚砜（DMSO）诱导。观察诱导过程中细胞的形态变化,并用免疫组化染色法鉴定细胞。结果全骨髓培养法成功分离培养BMSCs,免疫荧光染色示CD90、CD71、CD106表达阳性,CD45阴性。MTT法检测细胞活力示2、4、6代细胞于酶标仪490nm波长处吸光度值均高于第8、10代细胞。细胞经诱导后,细胞呈神经样细胞形态,并且神经元特异性表面标志β微管蛋白（β-Ⅲ-Tubulin）、巢蛋白（Nestin）、神经元特异性烯醇化酶（NSE）表达阳性。结论采用全骨髓培养法可获得较纯化的骨髓间充质干细胞,其在适宜的诱导分化条件下可诱导分化为神经样细胞。     

全骨髓法分离培养骨髓间充质干细胞及向神经样细胞分化的研究

目的 目前尚缺乏标准的骨髓间充质干细胞(BMSCs)的分离方法 ,实验通过全骨髓培养法分离纯化骨髓间充质干细胞,并诱导分化为神经样细胞,以寻找一种简便、实用的分离方法 .方法 取大鼠骨髓.全骨髓培养法结合差速贴壁法分离纯化大鼠骨髓间充质干细胞,传代扩增.倒置相差显微镜下观察骨髓间充质干细胞形态及生物学特点,免疫组化染色鉴定细胞.用MTT法间接测定不同代数细胞活力.诱导分化.先用碱性成纤维细胞生长冈子(bFGF)预诱导24h,然后加入丁羟基茴香醚诱导(BHA)和二甲基亚砜(DMSO)诱导.观察诱导过程中细胞的形态变化,并用免疫组化染色法鉴定细胞.结果 全骨髓培养法成功分离培养BMSCs,免疫荧光染色示CD90、CD71、CD106表达阳性.CD45阴性.MTT法检测细胞活力示2、4、6代细胞于酶标仪490 nm波长处吸光度值均高于第8、10代细胞.细胞经诱导后,细胞呈神经样细胞形态,并且神经元特异性表面标志β微管蛋白(β-Ⅲ-Tubulin)、巢蛋白(Nestin)、神经元特异性烯醇化酶(NSE)表达阳性.结论 采用全骨髓培养法可获得较纯化的骨髓间充质干细胞,其在适宜的诱导分化条件下可诱导分化为神经样细胞.     

星形胶质细胞与神经元在蚕丝素纳米纤维上的联合培养

目的:研究胶质细胞结合丝素纳米纤维对神经元生长发育的作用,为神经干细胞结合丝素蛋白材料用于临床移植修复神经系统损伤提供实验依据.方法:从新生大鼠脑室下区分离细胞与取自混合培养得来的星形胶质细胞共培养在柞蚕、家蚕2种丝素蛋白溶液制成的材料上,分别选取各时间段的细胞进行β-Ⅲ-tubulin特异性免疫荧光显色,并统计不同时间段神经元在丝素材料上的复杂度.结果: 神经元与星形胶质细胞共培养在柞蚕丝素无纺布上(TSF)的复杂度明显比家蚕丝素无纺布(SF)高.结论: 柞蚕、家蚕丝素无纺布结合星形胶质细胞支持神经元的生长,具有良好的生物相容性;胶质细胞结合柞蚕丝素无纺布比家蚕丝素无纺布更适合神经元的生长发育.     

成神经分化的骨髓间充质干细胞向C6细胞条件培养基和SDF-1α的趋化性迁移研究

目的:探讨成神经分化的骨髓间充质干细胞(BMSCs)向C6细胞条件培养基和SDF-1α的趋化性迁移.方法:采用碱性成纤维生长因子(bFGF)、丁羟基茴香醚(BHA)、二甲基亚砜(DMSO)联合诱导剂对BMSCs进行诱导分化, 通过免疫荧光染色检测诱导的细胞表达神经前体细胞标志物Nestin、β-III-Tubulin和NSE的情况.运用Dunn chamber研究成神经分化的BMSCs向胶质瘤和SDF-1α的迁移.结果:BMSCs能诱导分化成神经元样细胞, 而对照组的BMSCs形态无变化.Dunn chamber分析显示, C6细胞条件培养基组和SDF-1α组诱导细胞的迁移速率和迁移效率明显高于对照组, 表明C6细胞条件培养基和SDF-1α对BMSCs具有趋化作用, 单个细胞迁移轨迹实验也证实了这一结果.此外, 分化不同状态的BMSCs向C6细胞条件培养基和SDF-1α的趋化程度也不同.结论:BMSCs的定向迁移与分化状态密切相关.     

不同方法诱导大鼠骨髓间充质干细胞向神经样细胞的分化

目的观察两种方法体外诱导大鼠骨髓间充质干细胞（BMSC）向神经样细胞分化的效果。方法自大鼠股骨中提取骨髓细胞,利用Percoll法进行BMSC分离、纯化及鉴定。取第5代细胞,应用两种方法进行诱导。方法一（BHA组）：200μmol/L丁羟基茴香醚（BHA）、10 ng/ml碱性成纤维生长因子（bFGF）和2%二甲基亚砜（DMSO）联合诱导细胞;方法二（RA组）：全反式维甲酸（RA）和β-巯基乙醇（β-ME）联合诱导细胞。同时设正常培养的BMSC为对照组。实验过程中对细胞进行形态观察和免疫荧光染色检测神经细胞标志物。结果BHA组诱导5 h,细胞即发生明显的形态改变,出现胞体回缩、突触伸展等神经干细胞的形态特征,而RA组诱导1周未出现神经干细胞形态。免疫荧光染色显示两种方法诱导的细胞均能表达神经前体细胞标志物nestin、β-tubulin和成熟神经元标志物神经元特异性烯醇化酶（NSE）,不表达星形胶质细胞标志物胶质原纤维酸性蛋白（GFAP）。BHA组与RA组表达NSE的阳性率分别为80.05%和71.61%,两者相比,差异无统计学意义（P〉0.05）;对照组不表达NSE,诱导组与对照组比,差异有统计学意义（P〈0.05）。结论两种方法均能诱导骨髓间充质干细胞定向分化为表达神经细胞标志物的神经样细胞。