DRB对人喉癌Hep-2细胞系增殖、凋亡及侵袭作用的研究

目的探讨5，6二氯-1-β-D-呋喃核糖苯并咪唑（DRB）对人喉癌Hep-2细胞系增殖、侵袭及凋亡的影响及其作用机制。方法体外培养人喉癌Hep-2细胞，加入不同浓度的DRB，采用MTT法检测Hep-2细胞的增殖情况，流式细胞术观察Hep-2细胞凋亡率的变化，体外侵袭实验观察Hep-2细胞侵袭力的改变。结果DRB可抑制Hep-2细胞的增殖，呈时间和剂量效应关系。流式细胞仪检测二倍体峰前出现凋亡峰，10、20、40、80μmol／LDRB与Hep-2细胞共孵育24h后的细胞凋亡率分别为8．51％、11．26％、14．99％、25．31％。体外侵袭实验显示，DRB在10μmol／1，时即能抑制Hep-2细胞的体外侵袭力，随浓度提高，抑制作用增强。结论DRB能抑制Hep-2细胞增殖，降低细胞侵袭性，诱导细胞凋亡。     

Effect of DRB on the Biological Characteristics of Human Laryngeal Carcinoma Hep-2 Cell Line

In order to study the effect of 5, 6-Dichloro-1-β-D-ribofuranosyl-benzimidazole (DRB) on the biological characteristics of human laryngeal carcinoma Hep-2 cell line in vitro, Hep-2 cells cultured in vitro were treated with different concentrations of DRB. Changes in cell proliferation, apoptotic rate and invasiveness were detected by MTT assay, flow cytometry (FCM) and matrigel in vitro invasion assay, respectively. It was found that DRB inhibited the proliferation of Hep-2 cells in a dose- and time-dependent manner. After being treated with 0, 10, 20, 40, 80 μmmol/L DRB for 24 h, the apoptotic rate in Hep-2 cells was (0.68±0.19)%, (1.95±0.12)%, (8.51±0.26)%, (11.26±0.17)% and (14.99±0.32)%, respectively. The matrigel in vitro invasion assay revealed that DRB began to inhibit the invasion of Hep-2 cells at the concentration of 5 μmmol/L, and with the increase of DRB concen-tration, the inhibitory effect was enhanced. It was suggested that DRB could influence the essential biological characteristics of Hep-2 cells, inhibit Hep-2 cells proliferation, reduce invasive ability and induce apoptosis of Hep-2 cells.     

蛋白激酶CK2α特异性siRNA对人喉癌裸鼠移植瘤的抑制作用

目的：研究蛋白激酶CK2α特异性siRNA对人喉癌Hep-2细胞裸鼠移植瘤生长和蛋白激酶CK2α表达的影响。方法：裸鼠皮下种植人喉癌Hep-2细胞,肿瘤长到一定大小时,在肿瘤局部注射蛋白激酶cK2a特异性siRNA表达质粒,观察肿瘤生长情况,应用逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）检测蛋白激酶CK2α mRNA在肿瘤中的表达,应用免疫组织化学方法检测蛋白激酶CK2α蛋白在肿瘤中的表达。结果：转染蛋白激酶CK2α特异性siRNA表达质粒后,裸鼠移植瘤生长缓慢（P〈0．01）,裸鼠移植瘤中蛋白激酶CK2α mRNA和蛋白表达均较非特异干扰组和空白组明显下降（P〈0．05）。结论：蛋白激酶CK2α特异性siRNA表达载体可以下调裸鼠移植瘤中蛋白激酶CK2α表达,抑制肿瘤生长。RNA干扰技术可能成为治疗喉癌的一种新途径。     

胶质细胞源性神经营养因子及其在内耳中的研究进展

胶质细胞源性神经营养因子 (GDNF)是目前发现的活性最强的运动神经元神经营养因子之一 ,其在中枢神经系统和部分外周神经系统的作用已经在试验中得到了证实 ,随着GDNF在内耳研究的逐步进展 ,了解其在内耳中的作用将为神经营养因子在内耳中的广泛应用奠定基础     

细菌内同源重组制备重组腺病毒及其初步应用

目的通过细菌内同源重组方法构建重组腺病毒。方法质粒pAdTrack酶切线性化后，通过电转化方法转化AdEasier细菌，线性化的腺病毒重组质粒转染293包装细胞后获得重组腺病毒，观察腺病毒感染喉癌细胞Hep-2后的报告基因表达情况及病毒对培养细胞生长的影响。结果构建的重组腺病毒经酶切电泳鉴定正确；扩增的腺病毒转染培养的Hep-2细胞8 h后即开始表达报告基因，48 h后全部细胞均有报告基因表达；该重组的腺病毒对培养Hep-2细胞生长无明显影响。结论通过细菌内同源重组方法构建重组腺病毒，方法简单、成功率高、实验周期短。     

新生大鼠耳蜗Corti器体外培养及其转基因表达

目的建立新生大鼠耳蜗Corti器体外培养模型及观察外源基因表达。方法采用出生后1~3天龄大鼠,分离出的耳蜗Corti器组织置入表面覆盖有胶原凝胶的培养皿中,在含有10%DMEM液体培养基中培养;加入携带报告基因的腺病毒悬液,观察外源基因的表达。结果耳蜗Corti器体外培养8小时后,培养组织生长良好,形态结构清晰可辨,在该实验条件下,Corti器形态结构可以维持5天以上,最长达7天,随着培养时间的延长,由于周围组织生长的蔓延,Corti器的结构分界不清楚。腺病毒加入Corti器后12小时即有基因表达,24小时达到高峰,表达时间可持续1周。结论新生大鼠离体内耳组织转基因培养法是内耳Corti器体外培养实验研究的一种可行方法。     

蛋白激酶CK2α在喉鳞状细胞癌组织中的表达及临床意义

目的：探讨蛋白激酶CK2α（PK-CK2α）在喉鳞状细胞癌（LSCC）组织中的表达及临床意义。方法：应用免疫组织化学SP法检测50例LSCC组织（喉癌组）及10例正常舌腭弓黏膜组织（对照组）中PK-CK2α蛋白的表达情况,并采用图像分析系统对表达结果进行定量分析。结果：PK-CK2α蛋白在喉癌组中阳性表达率为64％（32／50）,在对照组中阳性表达率为30％（3／10）,2组比较差异有统计学意义（P〈0．05）。喉癌组和对照组之间PK-CK2α阳性表达的平均吸收度（A值）差异有统计学意义（P＜0．05）,喉癌组PK-CK2α阳性表达的A值与年龄、性别、临床分型（肿瘤部位）、临床TNM分期和淋巴结转移比较差异均无统计学意义,与病理分级（G1→G2加G3）有显著相关性（P＜0．05）。结论：PK-CK2α过表达可能与LSCC的发生和发展有关,检测PK-CK2α可作为判定LSCC恶性程度的潜在指标之一,抗PK-CK2α可能为肿瘤治疗提供一种新途径。     

重组腺病毒构建及介导报告基因在豚鼠耳蜗中的表达

目的：带绿色荧光蛋白（GFP）基因的重组腺病毒,为利用重组腺病毒介导外源基因转导内耳提供依据。方法：通过细菌内同源重组方法构建携带有报告基因的重组腺病毒（Ad-GFP）,将重组腺病毒经耳蜗底回途径导入豚鼠耳蜗鼓阶外淋巴后,观察手术后不同时间GFP基因在豚鼠耳蜗内的表达、分布情况;检测手术前后听觉脑干诱发电位,观察手术和病毒对豚鼠听觉功能的影响。结果：构建的重组腺病毒经酶切电泳鉴定正确;豚鼠耳蜗底回途径导入腺病毒24 h后即有报告基因表达,3 d后最高,表达时间可持续2周以上;报告基因表达部位主要分布在血管纹、鼓阶外淋巴面的间皮细胞和耳蜗Corti器等部位;听觉脑干诱发电位（ABR）在各组动物手术前后无明显改变。结论：成功构建了携带GFP基因的重组腺病毒,通过该方法构建的腺病毒可以介导报告基因在豚鼠耳蜗中表达,并且对豚鼠听觉功能无明显影响,为内耳基因治疗提供了理论依据。     

重组腺病毒构建及转染培养耳蜗Corti器和螺旋神经节细胞的实验研究

目的构建携带绿色荧光蛋白（GFP）基因的重组腺病毒,观察GFP基因在体外培养的新生大鼠耳蜗Corti器和螺旋神经节细胞的表达。方法通过细菌内同源重组方法构建携带有绿色荧光蛋白基因的重组腺病毒（Ad-GFP）,观察重组腺病毒转染培养的新生大鼠耳蜗Corti器和螺旋神经节细胞后,不同时间内绿色荧光蛋白基因的表达情况、表达部位及病毒对培养耳蜗Corti器和螺旋神经节细胞的影响。结果构建的重组腺病毒经酶切电泳鉴定正确;荧光显微镜下观察腺病毒转染体外培养的新生大鼠耳蜗Corti器和螺旋神经节细胞后,12 h即开始表达绿色荧光蛋白基因,24 h达到高峰,表达时间可持续1周;倒置显微镜观察转染后的Corti器和螺旋神经节细胞形态结构及生长无明显改变。结论本实验成功构建了携带绿色荧光蛋白（GFP）基因的重组腺病毒,通过该方法构建的腺病毒可以介导绿色荧光蛋白（GFP）基因在体外培养的新生大鼠耳蜗Corti器和螺旋神经节细胞中表达,但腺病毒本身对体外培养的耳蜗Corti器和螺旋神经节细胞生长无明显影响,为通过腺病毒进行内耳基因治疗提供了理论依据。     

人Bcl-2基因重组腺病毒的构建及其在螺旋神经节细胞中的表达

目的构建表达人Bcl-2基因的重组腺病毒，并研究其在原代培养螺旋神经节细胞(spiral ganglion cells，SGC)的表达特性。方法采用细菌内同源重组法，从pUC-CAGGS,／Bcl-2质粒中获得人Bcl-2 cDNA，克隆到腺病毒穿梭质粒pAdTrack-CMV上，后者和腺病毒骨架质粒pAdEasy-1在细菌内同源重组，在HEK293细胞中包装成为重组Ad增强型绿色荧光蛋白／Bcl-2腺病毒，电镜观察病毒颗粒，用病毒感染原代培养的大鼠螺旋神经节细胞，在荧光显微镜下观察感染效率，用逆转录聚合酶链反应方法检测Bcl-2基因在螺旋神经节细胞的转录表达，用Western Blot检测其蛋白的表达。结果经酶切鉴定证实重组腺病毒质粒构建成功，电镜显示包装细胞中有大量病毒颗粒存在，呈规则六边形。荧光显微镜下观测到感染病毒的SGC细胞发出明亮的绿色荧光。分别在mRNA水平及蛋白水平证实有外源性Bcl-2基因的表达。结论细菌内同源重组法是一种简便、高效的制备方法。构建的重组Ad增强型绿色荧光蛋白／Bcl-2腺病毒能有效的感染SGC，并可在SGC中正确地转录和翻译，为进一步研究腺病毒介导的Bcl-2基因对螺旋神经节损伤的保护作用奠定基础。