强力霉素调控的真核表达体系ALC-pTet-on Advanced成釉细胞株的建立

目的:建立可受强力霉素调控的高表达外源基因的真核表达体系ALC-pTet-on Advanced细胞株,用于基因功能的研究。方法:将质粒pTet-on Advanced转染至成釉细胞系(ALC),用1 000μg/mL的G418筛选抗性克隆。用RT-PCR进行DNA的整合鉴定,并瞬时转染荧光素报告基因(pTRE-Tight-Luc)对pTet-on Advanced阳性克隆株的功能进行鉴定。结果:G418压力筛选后,获得了13个细胞克隆株,RT-PCR检测均表达反义四环素转录激活子(rtTA Advanced),PCR产物测序结果与pTet-on Advanced基因序列一致,表明pTet-on Advanced基因片段已整合进小鼠成釉细胞基因组DNA,荧光素报告基因功能鉴定获得l株诱导表达倍率为22.1的克隆株,且pTet-on Advanced基因阳性的成釉细胞株的形态和生长度与正常成釉细胞没有明显差异。结论:通过脂质体转染的方法成功地获得l株诱导表达倍率为22.1的高表达成釉细胞株,为进一步研究EMPs在成釉细胞中功能打下了基础。     

人牙釉质蛋白Amelotin，Ameloblastin及Enamelin基因启动子的初步研究

目的分析人釉成熟蛋白（Amelotin,AMTN）、成釉蛋白（Ameloblastin,AMBN）与釉蛋白（Ename—lin,ENAM）基因上游启动子序列,构建不同长度的基因上游启动子报告基因载体,为进一步判断启动子序列的转录调控区奠定基础。方法利用软件分析基因启动子序列,以PCR方法获取基因上游启动子片段,将其构建至报告基因载体pGL3-Basic中。结果成功地获得了不同长度的Amelotin,Ameloblastjn及Enamelin基因启动子目的片段,酶切鉴定表明不同长度启动子荧光素酶报告基因载体构建成功。结论成功构建了不同长度启动子的pGL3．Basic荧光素酶报告基因载体,为进一步研究牙釉质蛋白2基因启动子的转录活性及转录调控特点奠定基础。     

敲低MSX2抑制小鼠成釉细胞釉基质蛋白表达及牙釉质形成

目的研究肌节同源结构域同源框基因2(MSX2)对小鼠成釉细胞釉基质蛋白的表达及牙釉质形成的影响。方法免疫化学染色检测出生后小鼠牙胚MSX2的表达情况及其在成釉细胞中的定位;设计并合成靶向小鼠MSX2基因的短发夹RNA(shRNA)寡聚单链DNA,将退火成双链的DNA构建到RNAi慢病毒载体pG MLV-SC5中,包装慢病毒;慢病毒感染成釉细胞,实时荧光定量PCR筛选最佳干扰片段,并检测釉原蛋白(Amelx)、成釉蛋白(Ambn)、釉蛋白(Enam)、釉成熟蛋白(Amtn)及激肽释放酶4(Klk4)在mRNA水平表达的改变。通过分离小鼠E18.5牙胚并感染靶向MSX2的RNAi重组慢病毒,种植于小鼠肾囊膜下,10周后,取出组织,分离并观察牙齿结构。结果 MSX2在小鼠成釉细胞分泌期及成熟期均有表达,但分泌期表达信号较弱,成熟期较强。成功包装靶向MSX2基因的RNAi慢病毒MSX2-shRNA,敲低MSX2基因表达可不同程度地降低成釉细胞Amelx及Klk4的mRNA水平。靶向MSX2基因的RNAi慢病毒感染牙胚后其牙釉质矿化程度降低。结论 MSX2基因在小鼠成釉细胞中表达,敲低成釉细胞MSX2并促进釉基质蛋白基因的表达和牙釉质的矿化。     

Runx2在牙釉质形成中的作用研究

目的:研究小鼠成釉细胞中Runx2对釉成熟蛋白(Amelotin,AMTN)、成釉蛋白(Ameloblas-tin,AMBN)、牙成釉细胞相关蛋白(odontogenic ameloblast-asssociated protein,ODAM)基因表达的调控作用,为研究Runx 2在牙釉质形成中的作用奠定基础.方法:通...     

锌指蛋白(ZNF)185在小鼠不同发育阶段睾丸中的表达

目的:研究锌指蛋白(ZNF)185在小鼠不同发育阶段睾丸中的表达。方法:从小鼠脑、肝、卵巢和不同发育阶段睾丸组织中提取总RNA,采用半定量RT-PCR法检测ZNF185的表达;制备小鼠不同发育阶段睾丸冰冻切片,应用免疫细胞化学分析法检测ZNF185蛋白的定位。结果:①ZNF185在睾丸中的表达显著高于脑、肝和卵巢组织。②ZNF185在小鼠性成熟前组睾丸中的表达显著低于性成熟期和老年期,而性成熟期和老年期之间差异不显著。③在性成熟前,ZNF185主要定位于睾丸间质细胞和类肌细胞;在性成熟期和老年期小鼠中,ZNF185主要定位于睾丸间质细胞、类肌细胞和精子。结论:ZNF185在小鼠性成熟后睾丸中的表达升高,定位更广泛。     

一种胚胎体外培养的新方法:滴中孔培养法

目的:建立并优化一种胚胎体外培养的新方法——滴中孔培养法。方法:用圆头玻璃管在培养皿上烫出多个圆孔,作为滴中孔培养的专用平皿;收集牛卵丘-卵母细胞复合体(COCs)并在滴中孔培养专用平皿中进行体外成熟(IVM)、体外受精(IVF)和体外培养(IVC)。结果:①滴中孔培养法与群卵共培养的效果相似,而单卵培养明显降低了卵母细胞的发育能力(P<0.05)。②培养滴体积和培养密度对卵母细胞核成熟没有明显的影响,但显著影响胚胎的发育能力。在培养密度不变的情况下,培养滴体积太小显著削弱了胚胎的发育能力,而培养密度过小或者过大也削弱胚胎的发育能力(P<0.05)。结论:滴中孔培养法可以达到群卵共培养的效果。     

61例重症胰腺炎手术患者的护理

重症胰腺炎发病急、死亡率高,多数患者需要手术清除坏死组织及腹腔引流,护理有一定的难度。     

FGF8辅助牙源性上皮诱导hDPSCs分化为成牙本质细胞及牙髓细胞

目的:研究成纤维细胞生长因子8(FGF8)对成人牙髓干细胞(hDPSCs)定向分化为成牙本质细胞及牙髓组织的影响。方法:首先分离、克隆培养hDPSCs,通过流式细胞术检测细胞表面标志物鉴定hDPSCs;矿化液中添加50μg/L的FGF8诱导hDPSCs分化,通过real-time PCR检测分化后的细胞中牙本质涎磷蛋白(DSPP)、碱性磷酸酶(ALP)、骨涎蛋白(BSP)和核心结合因子α1(Cbfa-1)在mRNA水平的表达;E11.5小鼠牙源性上皮联合FGF8与hDPSCs细胞团重组,再将组织块种植于裸鼠肾囊膜下培养,通过DNA原位杂交鉴定成牙本质细胞及牙髓细胞的来源。结果:成功分离培养hDPSCs,其表面标志物CD29和CD90呈阳性表达;经FGF8诱导的hDPSCs形成较明显的矿化结节,并且牙本质特异性蛋白DSPP、BSP及Cbfa-1表达量上调;E11.5小鼠牙源性上皮联合FGF8可以诱导hDPSCs分化为成牙本质细胞及牙髓细胞。结论:FGF8能够辅助牙源性上皮定向诱导hDPSCs分化为成牙本质细胞及牙髓细胞,并形成牙本质及牙髓腔结构。     

TGF-β1调控小鼠成釉细胞Amelotin基因表达的研究

目的：探讨TGF-β1对Amelotin基因表达的影响及作用机制。方法：通过实时定量RT-PCR法观察TGF-β1对釉成熟蛋白（Amelotin）基因表达的影响;利用TGFBR1小RNA干扰（siRNA）技术阻断TGF-β受体I（TGFBR1）表达,或在成釉细胞中过表达活化型TGF-β受体I（T204D）,观察Amelotin基因表达的改变;利用双荧光素酶基因报告系统观察TGF-β1和T204D对成釉细胞Amelotin启动子转录活性的调控作用。结果：TGF-β1刺激成釉细胞后,Amelotin基因表达显著增强;利用小RNA干扰技术使TGFBR1基因沉默,实时定量RT-PCR显示TGF-β1调控Amelotin基因表达的作用减弱,而pCDNA3.1-T204D转染成釉细胞促进了Amelotin基因表达。将pGL3-Amelotin启动子转染成釉细胞,并用TGF-β1刺激成釉细胞,Amelotin启动子的转录活性明显增强。TGFBR1小RNA干扰阻断了TGF-β1诱导的Amelotin启动子转录活性,而将pGL3-Amelotin与T204D共转染成釉细胞后,促进了Amelotin启动子的转录活性。结论：在牙釉质发育过程中,TGF-β1和活化型TGFBR1信号通路调控成釉细胞Amelotin基因表达。