应用间接ELISA方法检测兔轮状病毒抗体的初步研究

目的 建立间接ELISA方法对兔轮状病毒抗体进行检测。方法 确定抗原和阴、阳性参考血清的最佳工作浓度；进行特异性、敏感性以及中间试验。结果 抗原的最佳工作浓度为1：12000倍；参考血清的最佳工作浓度为1：200倍；本次实验建立的ELISA方法具有很好的敏感性和特异性；中间实验表明，LaRV在兔群中具有很高的感染率。结论 本次试验成功地建立了用于兔轮状病毒抗体检测的ELISA方法。     

兔轮状病毒的分离与鉴定

目的 从疑似病料中分离免轮状病毒。方法 从形态学、血清学、分子生物学等几个方面对其进行鉴定。结果 从几个方面鉴定的结果显示，疑似病料中含有兔轮状病毒(LaRV)病毒粒子。结论 本次实验成功地分离得到了LaRV病毒。     

DNMT3b对肝癌细胞株中DLC-1的表达及启动子区甲基化状况的影响

目的 探讨DNA甲基化转移酶3b(DNMT3b)对人肝癌细胞株SMMC-7721中DLC-1基因的表达及其启动子区甲基化状况的影响.方法 将SMMC-7721细胞株分为两组,试验组应用siRNA技术沉默DNMT3b的表达,对照组仅转染对照siRNA;应用Western Blot技术分别榆测两组细胞中DNMT3b和DLC-1的表达,并应用甲基化特异性PCR(MSP)技术分别检测两组细胞中DLC-1基因启动子区的甲基化状况.结果 试验组中DNMT3b的表达明显低于对照组,而DLC-1的表达明显高于对照组;两组中DLC-1启动子区甲基化状态无差异,均发生甲基化.结论 siRNA技术抑制DNMT3b的表达可使DLC-1基因表达水平增高,但DLC-1启动子区甲基化状态无变化.此过程中DNMT3b并非作为甲基转移酶,而可能是作为转录调控因子影响DLC-1的表达.     

猪2型圆环病毒原核表达产物的免疫原性测定

目的检测猪2型圆环病毒(PCV2)全基因组原核表达产物的免疫原性。方法根据PCV2JXL株序列(GenBank登录号AY491310),设计合成引物,利用多聚酶链式反应(PCR)从含有PCV2接种猪肾细胞PK15中扩增了Cap蛋白的氨基端片段(737-421nt),克隆入上游带有谷光苷肽-S-转移酶的原核表达载体pGEX-6p-1中,获得重组质粒pGEX-PCV737-421。PCV2Cap蛋白羧基端(426-37nt)和Rep蛋白已在过去的研究中分别融合表达。利用IPTG对3种重组大肠杆菌BL21进行诱导,进行聚丙烯酰胺凝胶电泳分析(SDS-PAGE)以及对PCV2阳性猪多抗血清的蛋白免疫印迹试验,在此基础上,将3种SDS-PAGE分离粗纯的重组表达产物碾碎后分别免疫BALB/c小鼠,用获得的抗鼠血清与PCV2病毒感染PK15细胞做间接免疫荧光抗体试验(IFA)。结果PCV2Cap蛋白的氨基端片段能在大肠杆菌中表达,且Cap蛋白羧基端和Rep蛋白的原核表达产物都能在免疫印迹试验中被PCV2阳性猪血清检测出特异性条带,重组蛋白免疫鼠血清可在IFA试验中观察到特异性的荧光分布,即检测到培养细胞中的病毒抗原。结论PCV2全基因组都可以用原核系统高效表达,且表达产物具有免疫原性。     

肝细胞肝癌中DNMT3 b、STAT3的表达及其相关性

目的 探讨DNA甲基转移酶3b(DNMT3b)、信号转导子与转录激活子3(STAT3)在肝细胞肝癌(HCC)中的表达及其意义.方法 用免疫组化SP法检测48例HCC组织,25例癌旁组织和15例正常肝组织中DNMT3b蛋白和STAT3蛋白的表达,并分析其相关性.结果 DNMT3t在HCC组织中的阳性表达率为81.3%,明显高于正常肝组织(6.7%)以及癌旁组织(44.0%)(P<0.05).STAT3在HCC组织中的阳性表达率为72.9%,显著高于癌旁组织(48.0%)和正常肝组织(20.0%)(P<0.05).在HCC中,DNMT3b和STAT3的表达呈正相关(P<0.05).结论 DNMT3b及STAT3的高表达与HCC的发生发展有关,DNMT3b可能作为转录调控因子与STAT3起协同作用.     

兔出血症病毒VP60基因在昆虫细胞中形成病毒样颗粒及其特性

目的将兔出血症病毒（RHDV）VP60全长基因在昆虫细胞-杆状病毒系统中表达，验证重组蛋白形成病毒样颗粒（VLPs）的能力及其生物学特性，探讨VLPs作为检测抗原及亚单位疫苗的潜力。方法用Bac-to-Bac系统体外表达RHDVVP60全长基因。以免疫荧光及Western blotting检测蛋白表达情况及确定蛋白最佳表达条件；免疫电镜观察VLPs形态，并对VLPs的血凝性、免疫原性进行检测。结果SDS-PAGE电泳分析表明，表达的重组蛋白分子量大小约为68KDa，在免疫荧光、琼脂扩散、ELISA试验中均与RHD多克隆抗血清特异性反应；接种重组病毒的Sf9细胞裂解液在电镜下可观察到与RHDV形态相似的VLPs；该VLPs可凝集人“O”、“B”型红细胞，凝集可被RHD多克隆抗血清所抑制；含VLPs的Sf9细胞裂解液可不经纯化用作间接ELISA抗原，所建立的ELISA方法与进口商品化试剂盒相比，特异性良好，敏感性、检出率稍低；将含VLPs的细胞裂解液加氟氏佐剂免疫兔，HI效价可达1∶40，可经受致死量病毒攻击。结论RHDV-VLPs的获得及其良好的免疫原性，为RHD血清学检测试剂的标准化、亚单位疫苗研制应用奠定基础，同时在转移载体及RHDV受体方面研究亦有潜在应用价值。     

肝细胞癌中FHIT、Survivin和Caspase-3的表达及意义

目的:研究脆性组氨酸三联体蛋白(FHIT)、Survivin和Caspase-3在肝细胞癌(HCC)中的表达及其意义。方法:通过免疫组化S-P法检测75例HCC及相应癌旁组织中FHIT、Survivin和Caspase-3的表达,分析其内在联系及与HCC临床病理特征的关系。结果:FHIT在HCC和癌旁组织中的表达阳性率分别为38.7%和69.3%,Survivin为86.7%和8%,Caspase-3为29.3%和84%,差别均有统计学意义(P<0.05)。FHIT蛋白的丢失与肿瘤的分化程度相关(P<0.05),与肿瘤大小、有无包膜、是否有门静脉癌栓、甲胎蛋白和HBsAg是否阳性无明显相关性。Survivin表达阳性率与肿瘤大小有关(P<0.05),与其他临床病理特征无关。Caspase-3蛋白的表达强度与HCC的分化程度和大小呈负相关(P<0.01)。在HCC中,FHIT与Survivin、Caspase-3与Survivin的表达呈负相关,FHIT与Caspase-3的表达呈正相关(P<0.05)。结论:FHIT和Caspase-3的表达缺失或下调与Survivin的过表达可能通过凋亡抑制共同参与了肝细胞肝癌的发生和发展。     

凝血酶敏感蛋白-1诱导肝癌裸鼠模型凋亡作用

目的研究TSP-1在人肝癌裸鼠种植瘤模型诱导凋亡的作用及作用机制。方法建立人肝癌细胞株HCCLM3裸鼠模型，治疗组和对照组（n=6）分别皮下注射TSP-1和生理盐水；治疗三周收集标本，采用Tunnel方法检测细胞凋亡水平，免疫组织化学方法检测Caspase-3蛋白的表达。结果TSP-1治疗组肝癌细胞凋亡指数显著高于对照组（9.36&#177;1.49VS2，64&#177;0．57，P〈0.01）。TSP-1组Caspase3蛋白（0．0581&#177;0．0185VS0．0908＋0．0210，P〈0，05）的表达显著高于对照组。结论TSP-1在人肝癌裸鼠模型中可诱导肝癌细胞凋亡，上调Caspase3的表达可能是TSP-1诱导细胞凋亡的作用途径之一。     

O型口蹄疫病毒VP1基因在昆虫细胞/杆状病毒中的表达

目的口蹄疫病毒的VP1蛋白是诱导中和抗体及激发保护性免疫应答的主要抗原蛋白,利用Bac-to-Bac杆状病毒表达系统表达VP1基因,为建立O型口蹄疫抗体血清学诊断方法奠定基础.方法将O型口蹄疫病毒VP1基因插入pFastBacHIa载体,构建重组质粒pFast BacHIa-VP1.将该重组质粒转化DH10Bac感受态细胞,VP1基因与Bacmid发生特异性位点转座.经PCR鉴定证实VP1基因正确地插入到病毒基因组多角体蛋白基因启动子下游,提取阳性质粒转染Sf9昆虫细胞.结果 SDS-PAGE电泳和Western blot检测结果表明VP1基因成功地在Sf9昆虫细胞中进行了表达,蛋白分子量为26.4kDa.结论 VP1基因在Bac-to-Bac系统中的成功表达为口蹄疫病毒VP1蛋白的抗原性、免疫原性以及免疫抗体水平检测研究奠定了基础.     

兔出血症病毒抗原捕获ELISA检测方法

为了有效地预防和根除山羊痘，研制能够区分自然感染和疫苗免疫的标记疫苗。本研究在山羊痘病毒（goat pox virus，GPV）疫苗株AV41胸苷激酶（thymidine kinase，TK）基因克隆、鉴定的基础上，构建转移载体。将痘苗病毒（Vaccinia Virus，VV）晚期启动子P11和大肠杆菌β-半乳糖苷酶基因（LacZ）报告基因片段插入含有TK片段同源臂的载体pTK的KpnI酶切位点，经酶切、PCR鉴定出，命名为pTK-LacZ。用脂质体法转染感染了GPVAV41株的犊牛睾丸（bovine testes，BT）细胞，待出现80%以上的细胞病变时收获病毒，经过连续9代蓝色蚀斑筛选、纯化和PCR鉴定，获得纯化的表达LacZ基因、TK功能缺失的重组病毒，命名为rGPV-LacZ。生物学特性研究显示，LacZ基因的插入不影响重组病毒的增殖特性，其毒力、生长特性与亲本株相似，保持原有疫苗株的生长特性，而且在BT细胞和羔羊睾丸（lamb testes，LT）细胞连续传20代遗传性状很稳定。本研究筛选、纯化的重组病毒rGPV-LacZ可以区分自然感染和疫苗免疫动物，为进一步研制山羊痘病毒基因工程标记疫苗奠定了基础。