ATP对大鼠BMSCs的死亡诱导作用及其机制的探究

【目的】 骨髓间充质干细胞(BMSCs)由于其来源方便、易于分离培养、具有多分化潜能、可自体移植等优点,在组织损伤修复领域受到了广泛关注。但早期大量的移植后细胞死亡是阻碍其发展的主要障碍之一。近年来研究表明局部微环境高浓度的ATP可能是导致细胞移植后死亡的因素之一。本课题将探究体外高浓度(>1 mmol/L)的ATP对大鼠BMSCs的死亡诱导作用及其是否与P2X7受体(P2X7R)和(或)Pannexin-1的激活有关,为减少BMSCs移植后死亡提供一条新的思路,以促进其在组织损伤修复中的应用。 【方法】 (1)细胞凋亡检测(CCK试剂盒; caspase-3蛋白检测;Annexin V/PI试剂盒);(2)染料摄取实验观察细胞膜孔隙形成以及激光共聚焦显微镜动态监测细胞内钙的变化;(3)细胞免疫荧光组织化学技术。 【结果】 (1)体外高浓度的ATP诱导大鼠BMSCs死亡;高浓度ATP (5、10 mmol/L) 处理大鼠BMSCs 24 h后细胞出现明显凋亡。蛋白质印迹结果显示10 mmol/L ATP 处理24、48 h后,细胞内caspase-3表达明显增加。(2)高浓度ATP诱导的大鼠BMSCs死亡的机制可能与细胞膜孔隙的形成和(或)细胞内钙超载有关;加入10 mmol/L ATP后,荧光显微镜观察显示细胞对 Ethidium Bromide染料的摄取明显增加,提示细胞膜上孔隙形成;通过激光共聚焦显微镜监测ATP干预后细胞内钙离子浓度的变化,结果显示ATP处理组细胞内Fluo-4荧光亮度随时间逐渐增强。这些数据提示高浓度ATP诱导的BMSCs死亡的机制可能与细胞膜孔隙的形成和(或)细胞内钙超载有关。(3)Pannexin-1半通道蛋白参与ATP诱导的BMSCs细胞毒性效应;细胞免疫荧光染色显示大鼠BMSCs有Pannexin-1表达。Pannexin-1的特异性阻断剂CBX可以部分阻断ATP诱导的BMSCs的死亡。(4)大鼠BMSCs表达P2X7R;细胞免疫荧光染色结果显示大鼠BMSCs表达P2X7R,但P2X7R的阻断剂oxATP不能逆转ATP诱导的细胞毒性作用。这可能是由于oxATP并不能特异性阻断P2X7R。下一步我们计划用特异性siRNA使大鼠BMSCs上P2X7R表达下调再进一步观察。 【结论】 高浓度的ATP诱导大鼠BMSCs死亡,其机制可能与细胞膜孔隙的形成和(或)细胞内钙超载有关;Pannexin-1参与了ATP诱导的大鼠BMSCs死亡作用。