cblN/Zap嵌合分子的构建及其对Jurkat细胞TCRζ的下调

目的:构建cblN/Zap嵌合分子,稳定转染Jurkat细胞后观察对细胞TCRζ的影响。方法:提取Jurkat细胞的总RNA并反转录为cDNA,以其作为模板用PCR方法扩增Zap基因的SH2片段。以含有人全长cblcDNA的质粒pEFHAcbl作为模板扩增cbl基因的N端(cblN),并在其N末端带上含24bp的flag标签。用重叠延伸PCR法,在cblN基因内部的SH2两端引入BamHI和EcoRV酶切位点并克隆入pcDNA3.1( )中。再以Zap基因的SH2置换cblN基因的SH2,即成为pcDNA3.1( )cblN/Zap。酶切鉴定及测序正确后,采用脂质体法稳定转染Jurkat细胞,用RTPCR和Westernblot鉴定flagcblN/Zap的表达,用Westernblot检测其对细胞TCRζ表达的影响。结果:重组质粒pcDNA3.1( )flagcblN/Zap经酶切后可产生与理论预期长度相符的片段。且测序证实其序列正确。脂质体法稳定转染Jurkat细胞后,检测到目的基因在RNA和蛋白水平的表达。表达的cblN/Zap可下调Jurkat细胞的TCRζ。结论:重构嵌合分子cblN/Zap可下调Jurkat细胞的TCRζ。     

人cbl 基因真核表达载体的构建及表达

目的: 构建带有flag标签的人cbl 基因真核表达载体,并检测其在真核细胞中的表达.方法: 以含有人全长cbl cDNA的质粒pEFHAcbl 为模板,采用PCR方法扩增cbl基因,并在其N-末端带上含24 bp的flag标签,克隆到pGEM-T easy载体并测序,再亚克隆至真核表达载体pcDNA3.1( ),酶切鉴定正确后采用脂质体法瞬时转染COS-7细胞,Western blot检测flag-cbl在细胞中的表达. 结果: 测序证实以pEFHAcbl 为模板获得的flag-cbl融合基因的序列以及读框全部正确;重组质粒pcDNA3.1( )-flag-cbl经酶切后产生与理论预期长度相符的片段;脂质体法转染COS-7后检测到预期目的蛋白的表达.结论: 成功构建了N-末端带flag标签的cbl真核表达载体,并使其在真核细胞COS-7中表达.