Lactoferricin B基因与几种变异克隆的构建及其在酿酒酵母中的表达与鉴定

目的 构建牛乳铁多肽(Lactoferricin B)的真核表达质粒pYES2/Lactoferricin B,实现其在酿酒酵母S.cerevisiae中的表达,并初步检测其不同变异的体外抗菌活性.方法 通过分别合成Lactoferricin B基因两条单链的部分序列,让其互为模板、引物进行PCR扩增,得到Lactoferricin B与3种变异的基因序列.将它们克隆到穿梭质粒pYES2中,构建pYES2/Lactoferricin B 及3种变异基因重组质粒,转化到大肠杆菌Top10中,让其大量增殖.提取重组质粒经纯化后将其转化到S.cerevisiae中,通过营养缺陷型筛选获得重组酵母菌并通过半乳糖诱导使其表达目的蛋白.经离子交换柱纯化收集目的蛋白后,通过体外抑菌实验比较Lactoferricin B及3种变异重组蛋白的抗菌活性.结果 经PCR扩增检验、DNA测序表明成功构建pYES2/Lactoferricin B与3种变异基因重组质粒.提取诱导后的蛋白进行SDS-PAGE电泳及质谱检测,证实目的蛋白的存在,相对分子质量约为3.4×103.在大肠埃希菌及金黄色葡萄球菌的抑菌实验中观测到Lactoferricin B和A17-Lactoferricin B产生了抑菌圈.结论 成功构建pYES2/Lactoferricin B及变异基因重组质粒,该重组质粒能在S.cerevisiae中诱导表达目的蛋白,为进一步研究其生物功能及抗菌活性奠定了基础.