低氧环境可体外促进人诱导多能干细胞分化为拟胚体

目的 探讨人诱导多能干细胞向拟胚体分化过程中,生理性低氧环境在拟胚体悬浮和贴壁阶段的影响及其相关机制。方法 本研究中拟胚体悬浮阶段分为悬浮常氧组（21% O2）和悬浮低氧组（5% O2）,贴壁阶段分为贴壁常氧组（21% O2）、贴壁低氧组（5% O2）、贴壁低氧组＋HIF-1α抑制剂Echinomycin。首先采用免疫荧光法鉴定人诱导多能干细胞的多能性,人诱导多能干细胞消化后分别在21%氧气和5%氧气条件下悬浮培养5 d,利用显微镜观察悬浮阶段拟胚体的形成和形态变化,5 d后检测拟胚体中三胚层标记基因的表达情况。接着分别取等量的拟胚体接种到明胶包被的培养皿,继续在21%和5%氧气条件下培养2 d,观察贴壁阶段拟胚体的粘附性能和粘附后向外周扩增速度的差异,检测低氧信号通路相关的HIF-1α、β-catenin和VEGFA的表达情况,随后在5%氧气条件下使用HIF-1α特异性抑制剂Echinomycin后,再次检测低氧信号通路相关的HIF-1α、β-catenin和VEGFA的表达情况。结果 常氧组和低氧组的拟胚体均具有三胚层分化的潜力。与常氧培养组相比,低氧组悬浮拟胚体周围的凋亡碎片明显减少,且较早出现囊性拟胚体,获得的拟胚体大小更加均匀一致。此外,低氧组的拟胚体贴壁数量明显高于常氧组（P<0.05）,拟胚体贴壁后向外生长的速度明显快于常氧组（P<0.05）。低氧组HIF-1α的mRNA未显著上调（P>0.05）,而β-catenin和VEGFA的mRNA显著上调（P<0.05）;在蛋白质水平,低氧信号通路相关的HIF-1α、β-catenin和VEGFA的表达均上调（P<0.05）。低氧组使用HIF-1α特异性抑制剂Echinomycin后,低氧信号通路相关的HIF-1α、β-catenin和VEGFA的蛋白质表达均下调（P<0.05）。结论低氧条件不影响拟胚体的三胚层分化潜力。生理性低氧可以促进悬浮拟胚体的形成和成熟,并且能增强拟胚体的贴壁和贴壁后增殖性能,初步证实通过激活HIF-1α/β-catenin/VEGFA信号通路,提升人诱导多能干细胞的分化能力。     

多孔隙三维环境下细胞接种密度对血管平滑肌细胞增殖行为的影响

目的 本研究拟在聚乙醇酸支架材料形成的多孔隙三维环境下,探究不同接种密度对人血管平滑肌细胞增殖行为的影响,并确定一个相对合适的接种密度区间,为后续构建组织工程血管选用种子细胞接种浓度进行初步探索。方法 将3种不同浓度的细胞悬液接种于聚乙醇酸支架材料上,通过免疫荧光,细胞增殖实验和免疫印迹,观察细胞的形态、黏附、增殖和表型。结果 细胞悬液接种后沿着支架材料生长,不同浓度的细胞悬液导致细胞形态、黏附和增殖发生变化,但是细胞收缩表型标志物α-平滑肌肌动蛋白(α-smooth muscle actin,α-SMA)及Calponin没有明显变化。当细胞悬液浓度为1×10⁷个/mL时,接种于支架后,细胞掉落的数目最少。当细胞悬液浓度为1×10⁶个/mL时,细胞增殖标志物增殖细胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen,PCNA)表达最多。结论 生长在支架材料上的血管平滑肌细胞的形态,黏附和增殖受到细胞接种浓度的影响,综合比较细胞的形态、黏附、增殖和表型,我们认为最佳的细胞接种浓度应为1×10⁶个...