基于斑马鱼模型比较宽体金线蛭和菲牛蛭对血管新生的影响

摘 要 目的：探讨及比较宽体金线蛭和菲牛蛭对Tg（kdrl:mCherry）斑马鱼的血管新生影响。方法: 将受精后 6 ~ 8 h（6 ~ 8hpf）的胚胎暴露在含不同浓度宽体金线蛭和菲牛蛭水提取物的胚胎培养液中,每24 h更换一次含药培养液。72 hpf时,在显微镜下观察发育形态和节间血管,测定48,72 hpf孵化率,72 hpf节间血管数目、心率。结果: 在抑制血管新生方面,宽体金线蛭组浓度≥30 μg· ml^-1时,菲牛蛭组浓度≥20 μg· ml^-1时,斑马鱼节间血管数目均较空白组明显减少（P<0.01）。毒性方面,在48 hpf,给药组浓度≥40 μg· ml^-1时,宽体金线蛭和菲牛蛭组斑马鱼的孵化率均较空白组明显降低（P<0.01）;在72 hpf,宽体金线蛭组斑马鱼的孵化率在100 μg·ml^-1时较空白组明显降低（P<0.01）,而菲牛蛭组斑马鱼的孵化率在80 μg· ml^-1就明显降低（P<0.01）。宽体金线蛭和菲牛蛭组斑马鱼的卵黄囊、心囊无明显水肿,脊柱未弯曲;两组心率显著降低（P<0.01）,但在正常心率范围内。结论: 宽体金线蛭和菲牛蛭都具有抗血管生成活性,且菲牛蛭的抗血管生成活性强于宽体金线蛭。两者对斑马鱼发育有一定程度的影响,但毒性不大。     

基于斑马鱼模型探讨马钱子的抗血管生成活性

目的：以斑马鱼为模型,探讨马钱子的抗血管生成活性。方法：以Tg（kdrl:mCherry）斑马鱼和野生斑马鱼为模型,在安全浓度范围内,分别采用荧光显像和体内碱性磷酸酶定量检测的方法,以PTK787为阳性对照,考察马钱子水提取物对斑马鱼血管生成的抑制作用。结果：与空白对照组比较,在一定的浓度范围内,低浓度的马钱子水提取物能抑制Tg（kdrl:mCherry）斑马鱼的节间血管生成,随着提取物浓度的增加抑制作用更加明显,抑制作用呈剂量依赖性。在碱性磷酸酶定量检测实验中,马钱子水提取物浓度为25μg·mL^-1时,血管生成抑制率为8.61%;浓度为100μg·mL^-1时,血管生成抑制率为26.16%;在一定的浓度范围内,马钱子处理组均表现出显著的抗血管生成活性（P<0.05）,血管生成抑制率与马钱子水提取物浓度成线性关系。结论：马钱子水提取物可以有效的抑制斑马鱼血管生成,有明显的抗血管生成活性。     

基于斑马鱼幼鱼模型的甘遂毒性评价

[目的]以模式生物斑马鱼幼鱼为模型,评价甘遂不同溶剂连续提取物毒性差异及毒性特征。[方法]采用索氏提取法获得甘遂不同溶剂连续提取物。通过预实验,确定各提取物72 h最大不致死浓度和最小全致死浓度。在此区间设定6~8个药物浓度,建立致死曲线,计算半数致死浓度（LC₅₀）。以毒性最大提取物的10%致死浓度（LC₁₀）、最小致死浓度（LC₁）、1/3 LC₁和1/10 LC₁为给药浓度,同时设立空白组和溶剂对照组,连续给药72 h,观察甘遂毒性特征。停药后将幼鱼置于养殖水中恢复48 h,观察毒性可逆性。[结果]甘遂不同提取部位毒性顺序为石油醚 > 二氯甲烷 > 乙酸乙酯 > 乙醇提取物。甘遂的主要毒性为肝毒性和胃肠道刺激性。肝毒性既可造成肝肿大,又可导致肝变性,肝肿大不可逆,而肝变性具有可逆性。[结论]本实验首次利用单个模型以相同浓度单次给药,同时评价了甘遂对心脏、肝脏、肾脏、神经系统和胃肠道等脏器系统的毒性作用及可逆性。实验结果证实了甘遂的毒性集中于石油醚提取部位,并可对肝脏和胃肠道造成实质性损伤。本实验为斑马鱼模型在中药毒性评价中的应用提供了参考。     

干扰TOX基因联合抗CD38CAR-T细胞的构建及其对血液肿瘤细胞增殖和凋亡能力的影响

目的 构建干扰胸腺细胞选择相关高迁移率群体盒(TOX)基因联合抗CD38 CAR-T细胞,观察其对血液肿瘤细胞增殖和凋亡能力的影响.方法 采集健康志愿者外周血,分离单个核细胞(PBMC),提取原代T淋巴细胞.构建以shRNA技术靶向抑制TOX的抗CD38 CAR分子,分别命名为TOX-shRNA1-CD38 CAR和T...     

基于斑马鱼幼鱼模型的甘遂毒性评价

[目的]以模式生物斑马鱼幼鱼为模型,评价甘遂不同溶剂连续提取物毒性差异及毒性特征。[方法]采用索氏提取法获得甘遂不同溶剂连续提取物。通过预实验,确定各提取物72 h最大不致死浓度和最小全致死浓度。在此区间设定6~8个药物浓度,建立致死曲线,计算半数致死浓度(LC50)。以毒性最大提取物的10%致死浓度(LC10)、最小致死浓度(LC1)、1/3 LC1和1/10 LC1为给药浓度,同时设立空白组和溶剂对照组,连续给药72 h,观察甘遂毒性特征。停药后将幼鱼置于养殖水中恢复48 h,观察毒性可逆性。[结果]甘遂不同提取部位毒性顺序为石油醚二氯甲烷乙酸乙酯乙醇提取物。甘遂的主要毒性为肝毒性和胃肠道刺激性。肝毒性既可造成肝肿大,又可导致肝变性,肝肿大不可逆,而肝变性具有可逆性。[结论]本实验首次利用单个模型以相同浓度单次给药,同时评价了甘遂对心脏、肝脏、肾脏、神经系统和胃肠道等脏器系统的毒性作用及可逆性。实验结果证实了甘遂的毒性集中于石油醚提取部位,并可对肝脏和胃肠道造成实质性损伤。本实验为斑马鱼模型在中药毒性评价中的应用提供了参考。     

应用CRISPR/Cas9技术构建Raji-Luc CD19 KO淋巴瘤细胞系

目的 应用CRISPR/cas9技术构建敲除CD19的Raji-Luc淋巴瘤细胞,并对其免疫逃逸能力进行初步验证。方法构建PB-CRISPR-CD19小向导RNA(small guide RNA, sgRNA)质粒,筛选最优的sgRNA序列,用pCAG-PBase转座酶、PB-CD19 sgRNA及PB-CRISPR-Cas9共同电转染Raji-Luc细胞,采用流式分选和极限稀释法筛选得到稳定敲除的单克隆细胞株。经过基因序列检测对敲除效果进行验证;酶标仪检测细胞系表面荧光素酶的表达情况;以实验室前期构建的CD19 CAR-T和CD38 CAR-T作为效应细胞,用荧光素酶化学发光法验证Raji-Luc CD19 KO细胞株的免疫逃逸能力。结果 电转染制备的Raji-Luc CD19 KO细胞转染效率较高,筛选所得两组单克隆细胞敲除效率均达到99%以上,与原始Raji-Luc细胞的荧光素酶表达无显著差异,且不能激活CD19 CAR-T细胞对其进行杀伤。结论 成功构建了Raji-Luc CD19 KO淋巴瘤细胞系。     

shRNA靶向抑制CD38的抗CD38 CAR-T细胞构建及其功能的初步鉴定

目的：探讨shRNA靶向抑制CD38的方法能否增强抗CD38 CAR-T细胞的抗癌功能。方法：构建shRNA靶向抑制CD38的抗CD38 CAR-T细胞的CAR分子,利用逆转录病毒载体包装成功后转导人原代T细胞,制备CAR-T细胞。实验分为shRNA1 CD38 CAR-T组、shRNA2 CD38 CAR-T组和对照组（shR-NC-CD38 CAR-T细胞）。采用qPCR法检测CAR-T细胞CD38 mRNA相对表达水平,计算CAR-T细胞培养0～14 d的增殖倍数,CFSE法检测CAR-T细胞与人Burkitt淋巴瘤细胞Raji-luc或人多发性骨髓瘤外周血B淋巴细胞RPMI-8226-luc共培养时的增殖情况,荧光素酶化学发光法检测CAR-T细胞在不同效靶比（1∶1、1∶2、1∶4、1∶8）时对Raji-luc和RPMI-8226-luc细胞的杀伤效率,ELISA法检测CAR-T细胞杀伤Raji-luc或RPMI-8226-luc细胞时上清液中IFN-γ水平,FCM检测CAR-T细胞表面耗竭T细胞生物标志物PD-1的表达水平。结果：shR-NC-CD38 CAR、shRNA1-...     

三棱化学成分及药理作用研究进展

三棱Sparganium stoloniferum为临床常用药材,近年来关注度一直较高。三棱中主要含挥发油、苯丙素类、黄酮类等化学成分,具有抗血栓、抗炎、镇痛、抗肿瘤等药理作用,其临床常用于治疗子宫内膜异位症、慢性萎缩性胃炎等。从本草考证、化学成分、药理作用3个方面对三棱近10年的研究进展进行综述,以期能为今后三棱的开发和利用提供参考。     

醋甘遂不同提取物对斑马鱼幼鱼的毒性

目的:研究非致死剂量醋甘遂对斑马鱼幼鱼的毒性及毒性可逆性,并验证斑马鱼模型用于中药毒性快速评价的可行性。方法:用索氏提取器以不同极性溶剂依次提取样品,制备不同提取物。将健康斑马鱼成鱼配对产卵,以正常发育受精后3 d的斑马鱼幼鱼为模型,用醋甘遂不同极性提取物处理斑马鱼幼鱼,统计给药72 h死亡率,对毒性最强的提取部位观察评价其对斑马鱼心血管系统、肝脏、神经系统、胃肠道系统、肾脏及其他脏器系统的毒性特征及可逆性。结果:醋甘遂不同溶剂提取物毒性顺序依次为石油醚提取物二氯甲烷提取物乙酸乙酯提取物乙醇提取物,与空白组比较,石油醚提取部位处理后的幼鱼给药组肝区相对光强度随给药浓度的升高而降低,肝脏颜色变暗(P0.01);肝脏经苏木精-伊红染色后,在石油醚提取部位0.054 mg·L~(-1)给药组中有轻微的肝损伤,在恢复组中肝损伤明显好转。与空白组和石油醚提取部位0.004 mg·L~(-1)组比较,肠道尼罗红排泄实验显示残留率在石油醚提取部位0.012,0.036,0.054 mg·L~(-1)组中显著下降(P0.01),胃肠道被促进排空。其他系统毒性特征不明显,差异均无统计学意义。结论:醋甘遂的石油醚、二氯甲烷、乙酸乙酯和乙醇提取物中,石油醚提取物毒性最大,且主要毒性为肝毒性和胃肠道刺激性,肝毒性造成肝变性,具有可逆性。斑马鱼模型快速评价中药毒性具有较好的应用前景。