骨髓间充质干细胞向肝细胞样细胞的诱导分化

目的:探讨大鼠骨髓间充质细胞向肝细胞祥细胞的诱导分化,观察诱导分化细胞的形态和分子生物学特性,及其对急性肝损伤大鼠的治疗作用.方法:分离、培养并纯化大鼠骨髓间充质细胞.培养基中加入肝细胞生长因子(HGF)、纤维生长因子-4(FGF-4)及上皮细胞生长因子(EOF),分别于7、14、21、28 d观察细胞形态变化,采用RT-PCR方法检测细胞白蛋白(ALB)、甲种胎儿球蛋白(AFP)、细胞角蛋白-18(CK-18)的mRNA表达.将诱导分化28 d的细胞经DAPI染料染色后,经门静脉注入同种异体大鼠体内,经24、48、72及168 h分批处死大鼠,观察大鼠肝组织内荧光细胞的分布.大鼠腹腔注射硫代乙酰胺制作急性肝衰竭模型,将1×106及5×106个诱导分化细胞经门静脉注入大鼠体内,经48、168 h采血查肝功,168 h处死大鼠,取肝组织病理学检查.结果:大鼠间充质细胞经上述3种细胞因子诱导后,形态和生物学行为方面都发生向肝细胞样细胞方面的转化,经门静脉注入大鼠体内后,有大量该种细胞在肝组织内分布,24 h荧光细胞最多,随时间延长逐渐减少,可持续7 d.骨髓间充质细胞的诱导分化细胞经门静脉注入肝损伤模型大鼠体内后,大鼠肝功能有所好转,注入1×106细胞大鼠ALT由注入前238.0±113.5 U/L,48 h后降至189±68.4 U/L,168 h后降至149.0±54.2 U/L,TBIL由注入前2.9±1.6 μmol/L,48 h至3.0±1.4 μmoI/L,168 h至1.3±0.3 μmol/L;注入5×106个细胞者(ALT)由注入前238.0±113.5 U/L,48 h后降至169.7±46.0U/L,168 h后降至103.7±46.0 U/L,TBIL由注入前2.9±1.6μmol/L,48 h至2.9±1.3μmol/L,168 h至0.9±0.3 μmol/L.结论:大鼠骨髓间充质细胞可在某些细胞因子的诱导作用下发生类肝细胞样转化,将转化细胞经门静脉植入同种异体大鼠体内后可在肝组织内存活并对大鼠肝损伤有一定修复作用.     

DMSO、地塞米松对于HBV感染HepCHLine-4细胞能力的影响

目的 评价二甲基亚砜（DMSO）、地塞米松对于乙型肝炎病毒（HBV）感染HepCHLine-4细胞能力的影响。方法 HBV感染前将HepCHLine 4细胞分为DMSO处理组（A组）、地塞米松处理组(B组)、DMSO及地塞米松处理组(C组)和对照组(D组)。含胎牛血清100mL/L 的细胞培养基中,A组添加20mL/L DMSO,B组添加5×10-5 mol/L 地塞米松,C组添加20mL/L DMSO及5×10-5 mol/L地塞米松,D组不添加上述两种试剂。用相应培养基培养各组细胞4d以备病毒感染。将HBV病毒颗粒加入各组细胞中于37℃中孵育24h。电化学发光法检测感染后各组细胞培养上清中HBsAg和HBeAg的滴度;荧光定量PCR检测感染后各组细胞培养上清的HBV DNA。结果 DMSO处理组HBsAg和HBeAg的滴度相对较高;地塞米松处理组HBV DNA值相对较高;DMSO及地塞米松处理组HBsAg和HBeAg的滴度及HBV DNA值均较高,其最高值分别是125.790 IU/mL, 4.784 S/Co, 5.930×105 copies/ mL;对照组HBsAg和HBeAg的滴度及HBV DNA值均较低,其最高值分别是85.490 IU/mL,1.896 S/Co,3.729×104 copies/mL。 结论 DMSO、地塞米松有提高HepCHLine 4细胞被HBV自然感染能力的趋势。     

新型乙型肝炎病毒细胞感染模型的建立

目的:建立一新型细胞株,使该细胞株既能自然感染HBV又能传代培养,评价杂交细胞对HBV的自然感染能力.方法:分离培养未携带HBV的人原代肝细胞,与诱导突变的HepG2细胞进行融合得杂交细胞,经HAT培养基筛选,利用胰蛋白酶G显带技术鉴定所得细胞,用含HBV的慢性乙型肝炎患者血清感染杂交细胞(同时感染HepG2作为对照),巢式PCR检测感染后细胞内HBVDNA合成及分泌情况及有无HBV复制中间产物HBV cccDNA,间接免疫荧光检测感染后细胞内HBcAg的表达,电化学发光法检测感染后细胞培养上清中的HBsAg和HBeAg.结果:成功建立人原代肝细胞与HepG2的杂交细胞,能体外传代培养,染色体核型分析示杂交细胞染色体众数为99条,证实为融合细胞,HBV感染后第4天起,杂交细胞内和培养上清中均能检测到HBV DNA,HBV感染后第3天起,杂交细胞内可以检测到HBV的复制中间产物HBV cccDNA,HBV感染后第4天起,杂交细胞胞质及部分胞核内HBcAg始终是阳性表达,间接免疫荧光染色呈胞质弥漫性着色,电化学发光法检测培养上清中HBsAg及HBeAg持续表达;而感染后的HepG2细胞检测结果均为阴性.结论:成功建立的兼具有人原代肝细胞和HepG2遗传特性的杂交细胞株可以被慢性乙型肝炎患者血清中的HBV病毒自然感染,可进一步用作研究HBV感染的体外细胞模型.