VEGF基因修饰兔骨髓间充质干细胞的研究**☆

背景：血管内皮生长因子的应用是组织工程组织血管化的有效手段。但是，血管内皮生长因子价格昂贵，并且半衰期非常短，很难在体内保持有效的作用浓度。故本实验将其转入组织工程的种子细胞——骨髓间充质干细胞中，使骨髓间充质干细胞能够有效地分泌血管内皮生长因子，从而达到促进血管生成的目的。 目的：探讨应用人血管内皮生长因子165进行基因修饰的可行性，为血管化组织工程组织的构建及缺血性疾病的治疗奠定实验基础。 设计：观察对比实验。 单位：吉林大学第一医院和吉林大学再生医学科学研究所。 材料：实验于2003-06/2004-08 在吉林大学再生医学科学研究所吉林大学重点实验室（生物安全实验室二级）完成。健康新西兰大耳白兔由吉林大学实验动物中心提供。4.0~5.0 月龄，体质量215~315 kg，雌雄兼用，实验过程中对动物处置均在麻醉状态、无菌条件下完成，符合动物伦理学标准。实验药品及试剂：Ham F12 培养基( GIBCO公司)，噻唑蓝(MTT) ( Sigma 公司)，pLXSN-KDRp-VEGF165 与pcDNA3.0 载体由本实验室自备, ELISA 检测试剂盒(深圳晶美生物公司)，感受态大肠杆菌DH5α、限制性内切酶BamH I、Xho I、HandIII、EcoR I 和标准DNA 分子( Promega 公司) 。 方法：分离、培养新西兰大白兔骨髓间充质干细胞。构建并鉴定pcDNA3.0-VEGF165 真核表达载体，利用脂质体介导其转染骨髓间充质干细胞，采用ELISA 方法检测转基因骨髓间充质干细胞的人血管内皮生长因子蛋白表达，MTT 法检测转基因骨髓间充质干细胞表达物对血管内皮细胞增殖活性的影响，设单纯培养骨髓间充质干细胞及pcDNA3.0 转染骨髓间充质干细胞组为对照组。 主要观察指标：①重组质粒双酶切和基因测序分析。②ABC-ELISA 法观察质粒转染后的骨髓间充质干细胞的人血管内皮细胞生长因子蛋白表达。③通过MTT 法检测人血管内皮生长因子165 基因转染骨髓间充质干细胞培养上清对血管内皮细胞增殖的影响。 结果：①构建的质粒用Hind III 和Xho I 双酶切、琼脂糖凝胶电泳鉴定结果与预期完全相同，PCR 和酶切鉴定正确后行测序鉴定，测序结果正确，证明所构建的质粒为pcDNA3.0-VEGF165 重组质粒。②ABC-ELISA 法检测结果表明，人血管内皮生长因子165 基因重组载体转染骨髓间充质干细胞后24 h，即有较高水平的人血管内皮生长因子165 蛋白表达，48 及72 h 呈下降趋势，但与对照组比较，差异显著( P < 0.05) 。③MTT 法检测人血管内皮生长因子165 基因转染骨髓间充质干细胞培养上清对血管内皮细胞增殖的影响，结果显示，含2%, 4%, 8%, 16%和32%转染人血管内皮生长因子165 基因的骨髓间充质干细胞培养上清促血管内皮细胞增殖率均高于对照组 ( P < 0.05) 。 结论：人血管内皮生长因子165基因可成功地转染至骨髓间充质干细胞中，并可进行有效地表达。     

VEGF基因修饰兔骨髓间充质干细胞的研究

背景:血管内皮生长因子的应用是组织工程组织血管化的有效手段.但是,血管内皮生长因子价格昂贵,并且半衰期非常短.很难在体内保持有效的作用浓度.故本实验将其转入组织工程的种子细胞--骨髓间充质干细胞中,使骨髓间充质干细胞能够有效地分泌血管内皮生长因子,从而达到促进血管生成的目的.目的:探讨应用人血管内皮生长因子165进行基因修饰的可行性,为血管化组织工程组织的构建及缺血性疾病的治疗奠定实验基础.设计:观察对比实验.单位:吉林大学第一医院和吉林大学再生医学科学研究所.材料:实验于2003-06/2004-08在吉林大学再生医学科学研究所吉林大学重点实验室(生物安全实验室二级)完成.健康新西兰大耳白兔由吉林大学实验动物中心提供.4.0～5.0月龄,体质量215～315 kg,雌雄兼用,实验过程中对动物处置均在麻醉状态,无菌条件下完成,符合动物伦理学标准.实验药品及试剂:Ham F12培养基(GIBCO公司),噻唑蓝(MTT)(Sigma公司),pLXSN-KDRp-VEGF165与pcDNA3.0载体由本实验室自备,ELISA检测试剂盒(深圳晶美生物公司),感受态大肠杆菌DH5α、限制性内切酶BamH Ⅰ、Xho Ⅰ、HandⅢ、EcoR Ⅰ和标准DNA分子(Promega公司).方法:分离、培养新西兰大白兔骨髓间充质干细胞.构建并鉴定pcDNA3.0-VEGF165真核表达载体,利用脂质体介导其转染骨髓间充质干细胞.采用ELISA方法检测转基因骨髓间充质干细胞的人血管内皮生长因子蛋白表达,MTT法检测转基因骨髓间充质干细胞表达物对血管内皮细胞增殖活性的影响,设单纯培养骨髓间充质干细胞及pcDNA3.0转染骨髓间充质干细胞组为对照组.主要观察指标:①重组质粒双酶切和基因测序分析.②ABC.ELISA法观察质粒转染后的骨髓间充质干细胞的人血管内皮细胞生长因子蛋白表达.③通过MTT法检测人血管内皮生长因子165基因转染骨髓间充质干细胞培养上清对血管内皮细胞增殖的影响.结果:①构建的质粒用Hind Ⅲ和Xho Ⅰ双酶切、琼脂糖凝胶电泳鉴定结果与预期完全相同,PcR和酶切鉴定正确后行测序鉴定,测序结果正确,证明所构建的质粒为pcDNA3.0-VEGF165重组质粒.②ABC-ELISA法检测结果表明,人血管内皮生长因子165基因重组载体转染骨髓间充质干细胞后24 h,即有较高水平的人血管内皮生长因子165蛋白表达,48及72 h呈下降趋势,但与对照组比较,差异显著(P＜0.05).③MTT法检测人血管内皮生长因子165基因转染骨髓间充质干细胞培养上清对血管内皮细胞增殖的影响,结果显示,含2%,4%,8%,16%和32%转染人血管内皮生长因子165基因的骨髓间充质干细胞培养上清促血管内皮细胞增殖率均高于对照组(P＜0.05).结论:人血管内皮生长因子165基因可成功地转染至骨髓间充质干细胞中,并可进行有效地表达.     

组织工程技术栓塞动脉瘤的初步实验研究

目的：通过家兔颈动脉血管造影来观察成纤维细胞-纤维蛋白胶栓塞动态瘤的效果。方法：采用组织工程技术在体外建立成纤维细胞库，并将成纤维细胞在人纤维蛋白胶中三维培养，直视下用成纤维细胞-纤维蛋白胶复合物栓塞兔动脉瘤模型。32例（成纤维细胞复合物14例，纤维蛋白胶14例，空白4例）分别于栓塞2、4周行DSA血管造影。结果：（1）成纤维细胞能够在纤维蛋白胶中良好生长。（2）成纤维细胞-纤维蛋白胶组栓塞效果明显优于纤维蛋白胶组。结论：成纤维细胞-纤维蛋白胶可以栓塞动脉瘤。     

转基因组织工程骨体内移植修复颅骨缺损的实验研究

目的 采用血管内皮生长因子(VEGF)转基因组织工程骨对兔颅骨缺损模型进行修复,对转基因技术在颅骨组织工程方面的应用进行初步探讨.方法 建立兔颅骨缺损模型,以转基因MSCs与成骨诱导后的MSCs混合作为种子细胞构建的组织工程骨进行移植修复,以单纯组织工程骨为对照.通过血生化检查、组织学观察、X线检查以及组织学评分等指标来判断修复效果.结果 转基因组织工程骨较单纯组织工程骨成骨细胞生长、增殖、血管形成更活跃,其成骨能力明显增强.结论 VEGF转基因组织工程骨能加快修复区的骨形成,可望为临床大块颅骨缺损修复提供有效方法.     

血管内皮生长因子基因在兔骨髓间充质干细胞中的转染和表达

目的：探讨应用人血管内皮生长因子165 (hVEGF₁₆₅)进行基因修饰的可行性，为血管化组织工程组织的构建及缺血性疾病的治疗奠定实验基础。方法：构建pcDNA3.0-VEGF₁₆₅真核表达载体，利用脂质体介导转染兔骨髓间充质干细胞（MSCs），ELISA方法检测转基因MSCs的hVEGF蛋白表达情况，MTT法检测转基因MSCs表达物对血管内皮细胞增殖活性的影响，设单纯培养MSCs及pcDNA3.0转染MSCs组为对照组。结果：成功构建hVEGF真核表达载体，并成功地将其转入MSCs中；MSCs细胞在转染 pcDNA3.0-VEGF₁₆₅ 质粒24、48和72 h后，其培养上清中hVEGF蛋白表达量均较对照组显著升高（P<0.05），至G418筛选后12代，转基因MSCs培养上清中仍有hVEGF蛋白的表达，含2%、4%、8%、16%和32%转基因细胞培养上清的培养液均明显增加血管内皮细胞的增殖率，与对照组比较，差异均具有显著性（P<0.05）。 结论： hVEGF₁₆₅基因成功地转染至MSCs中，并可进行有效地表达。