赖型钩体flaB2与VR1012中的CpG基序分析

目的：对问号赖型钩端螺旋体（赖型钩体）DNA疫苗[包括内鞭毛蛋白基因（flaB2)和质粒DNA表达载体（VR1012）]的CpG基序（CpG motifs)进行分析，为DNA疫苗免疫机制的阐明和提高DNA疫苗的效能奠定基础。方法：以flaB2与VR1012构建重组DNA的免疫原，对flaB2及VR1012全核苷酸序列进行计算机分析（分类、计数和定位）。结果：CpG的“C”的侧翼为两个嘌呤，“G”的侧翼为两个嘧啶，在flaB2中共3个，分别为GACGCT，GACGTC和GACGCC；在VR1012中共11个，分别为GACGTC1个，GACGCT2个，GACGCC1个，GACGTT1个，GGCGTT2个，GGCGCT2个，GGCGCC1个，AACGCT1个，其中特别重要的TGACGTCA4个和TAACGCCA有1个，位于5'端456－463；509－516；592－599；778－785和486－493；4个TGACGTCA和1个TAACGCCA均位于5'端且相对集中。结论：赖型钩体flaB2与VR1012构成的DNA疫苗含有TGACGTCA等CpG，这些基序又称免疫刺激序列，构成了DNA疫苗中的佐剂。     

问号赖型钩端螺旋体内鞭毛蛋白基因与质粒DNA表达载体中CpG特定核苷酸序列及其在DNA疫苗中的作用

目的对赖型钩体DNA疫苗包括内鞭毛蛋白基因和质粒DNA表达载体的CpG特定结构进行分析,为DNA疫苗免疫机制的阐明和提高DNA疫苗的效能奠定基础.方法以flaB2与VR1012构建重组DNA的免疫原,对内鞭毛蛋白基因(flaB2)及质粒DNA表达载体(VR1012)全核苷酸序列进行计算机分析.以flaB2与VR1012构建重组DNA进行NZW兔免疫原实验及豚鼠保护实验.结果flaB2共846bp,G+C%为47.9%;赖型钩体全基因组G+C%为36.8%,内鞭毛的G+C%比基因组高;CG特定核苷酸序列共51个,平均16.59%个bp有1个;flaB2中CpG的"C”的侧翼为两个嘌呤,"G”的侧翼为两个嘧啶共3个,分别为GACGCT1个,GACGTC1个,GACGCC1个;质粒DNA表达载体VR1012共4914bp,G+C%为49.4%,CG特定核苷酸序列共250个,平均19.66个bp有1个,VR1012中CpG的"C”的侧翼为两个嘌呤,"G”的侧翼为两个嘧啶共16个,分别为GACGTC5个,GACGCT2个,GACGCC1个,GACGTT1个,GGCGTT2个,GGCGCT2个,GGCGCC1个,AACGCT1个,AACGCC1个和特别重要的TGACGTCA4个和TAACGCCA有1个,位于5′端456-463;509-516;592-599;778-785,486-493;4个TGACGTCA和1个TAACGCCA均位于5′端且相对集中.TCG分散共53个,TCGTCG共1个,位于1873-1878,NZW兔免疫原实验及豚鼠保护实验的结果表明,加强注射接种后3周"VR1012+flaB2”组动物抗体效价增高(16倍),试验组存活率为90%.结论研究结果表明赖型钩端螺旋体内鞭毛蛋白基因及其质粒DNA表达载体构成的DNA疫苗具有明显的免疫原性和免疫保护作用,经DNA分析表明DNA疫苗中特别是质粒表达载体含有TGACGTCA等特定结构,是提高DNA疫苗免疫效能,减少疫苗免疫接种剂量一种行之有效的措施.     

问号赖型钩体与七日热型钩体内鞭毛蛋白基因的克隆及序列分析

目的　筛选钩体核酸疫苗的候选株 ,并从基因水平解释钩体血清型的特异性。方法　通过 PCR方法扩增赖型 0 17株及七日热型 5 6 6 10株钩体的内鞭毛蛋白 (fla B)基因 ;经 T/A快速克隆法将 PCR产物连接于PGEM- T Easy Vector载体。用 α-互补法、PCR法及酶切分析鉴定重组质粒 ,获得了重组质粒 p DHTF0 17和p DHTF6 10 ;双脱氧终止法对两个重组质粒中的克隆化 fla B基因进行测序。结果　两型 fla B基因长 85 2 bp,编码2 83个氨基酸。两个基因的限制性内切酶位点相似 ,含多个常见酶切位点。基因编码的蛋白质预测相对分子质量为31.3× 10 3。结论　几个血清型的 fla B基因同源性达 90 %～ 99%。     

问号赖型钩体017株与七日热型钩体56610株内鞭毛蛋白基因的克隆及序列分析

目的通过不同型钩体DNA序列分析筛选钩体基因疫苗的候选株,并从基因水平解释钩体血清型的特异性.方法(1)酚、氯仿抽提法提取017株与56610株钩体基因组DNA.(2)分别以017株与56610株钩体基因组DNA为模板,PCR法扩增内鞭毛蛋白(flaB)基因.(3)T/A快速克隆法将两个flaB基因的PCR产物连接与Teasy-vector载体.(4)α-互补、PCR法初步筛选重组质粒.(5)碱裂解法小量提取质粒、酚切分析进一步鉴定重组质粒,确定外源基因插入方向.(6)双脱氧终止法对重组质粒的克隆化flaB基因进行测序.(7)应用软件对所测序列进行酶切位分析及编码蛋白的预测.(8)与已发表的钩体内鞭毛基因进行比较.结果经鉴定获得了两个重组质粒pDHTF017与pDHTF610.pDHTF017中flaB基因为反向插入,pDHTF610中的flaB基因为正向插入.两个重组外源flaB基因长度均为852bp,编码蛋白含283个氨基酸,预测分子量为31.5kD左右.两个基因的限制性内切酶位点相似,含多个常见酶切位点.几个血清型钩体的flaB基因比较发现型间同源性很高(90%-99%),变异通常发生在固定位点,各型选择不同的固定位点.结论(1)重组质粒pDHTF017与pDHTF610中的外源基因均为钩体的一种flaB基因;(2)flaB基因保守性强,可作为基因疫苗的靶基因;(3)七日热型钩体56610株的flaB基因有望成为核心抗原基因,可进行钩体疫苗的研究开发.