生长激素对MOLT-4细胞增殖的影响

生长激素(GH)是由脑垂体前叶嗜酸性细胞所分泌的生长刺激因子[1].我们通过研究rhGH是否对人T淋巴细胞型白血病细胞株(Molt4)具有增殖作用以及观察生长激素受体(GHR)在Molt-4细胞中的表达,以期为rhGH的临床研究提供实验依据.     

利用可控表达Cyclin B1的单克隆细胞株寻找与Cyclin B1结合的蛋白

目的 利用已经构建好的四环素诱导细胞周期素B1 (Cyclin B1)表达的单克隆细胞株,探索可能与Cyclin B1相互作用的蛋白.方法 加入四环素的单克隆细胞株能表达带有Myc和His标签的Cyclin B1.将未诱导和用四环素诱导48 h的细胞裂解后,分别加入10μg Myc的单克隆抗体,用免疫沉淀法(immune precipitation,IP)沉淀可能和Cyclin B1相作用的蛋白,将蛋白混合物行聚丙烯酰胺凝胶电泳,用考马斯亮蓝染色法和银染法明确差异蛋白,再用质谱(mass spectrometry,MASS)行蛋白鉴定.结果 用质谱鉴定出的蛋白有细胞周期素依赖蛋白激酶1(Cyclin-dependent kinase 1,CDK1),细胞周期素依赖蛋白激酶2(Cyclin-dependent kinase 2,CDK2),有丝分裂阻滞缺失样蛋白1(Mitotic arrest deficient-like protein 1,MAD1-like 1,MAD1L1)和热休克蛋白8(heat shock 70kD protein 8 isoform 1).结论 除Cyclin B1和CDK1直接相互作用外,Cyclin B1与CDK2、MAD1L1和热休克蛋白8都可能有直接或间接的相互作用.     

G0/G1期异时相Cyclin B1的表达对细胞凋亡的影响

目的 研究G0/G1期异时相细胞周期素B1(Cyclin B1)的大量表达对细胞凋亡的影响.方法 首先构建了四环素可诱导表达Cyclin B1的单克隆细胞株,其次,筛选出能最大程度阻滞细胞于G0/G1期的胸腺嘧啶核苷(Thymidine)浓度,最后,在阻滞的时间内加入四环素诱导Cyclin B1表达,并用免疫印迹和流式细胞仪检测证实后,用膜联蛋白/碘化丙啶(Annexin Ⅴ/PI)双染法和API法检测细胞凋亡.结果 终浓度为5 mmol/L的胸腺嘧啶核苷能阻滞单克隆细胞株在G0/G1期,并至少维持48 h;在细胞同步化期间加四环素诱导后,Cyclin B1表达增加,并且G0/G1期特异性细胞凋亡增加.结论 G0/G1期异时相Cyclin B1的表达能诱导细胞凋亡.     

四环素诱导可控表达细胞周期素B1单克隆的筛选

目的 筛选四环素诱导细胞周期素B1(Cyclin B1)可控表达的293单克隆细胞株(tetracycline-regulated expression 293 cells,T-RExTM-293).方法 从人胎肝cDNA文库中PCR带有酶切位点的Cyclin B1基因全长,将其酶切后插入到pcDNA4/TO/myc-HisB载体中.然后用测序正确的质粒转染T-RExTM-293细胞,加杀稻瘟菌素(Blasticidin)和腐草霉素(Zeocin)双药物筛选两周后,传96孔板,等单个细胞扩增出单克隆.然后用Western印迹和流式细胞仪检测Cyclin B1的诱导表达情况.结果 构建好的pcDNA4/TO/myc-HisB-Cyclin B1载体,经鉴定序列正确.筛选出的单克隆细胞株,在未加四环素时没有外源性的Cyclin B1表达,在加入四环素后,3 h就有表达,随时间的增加,Cyclin B1表达量也增加,48 h最多.结论 筛选出的T-RExTM-293单克隆细胞株能可控表达Cyclin B1.     

异时相Cyclin B1/CDK1表达有助于正常在体细胞进入细胞分裂周期

目的 研究通常表达于G2/M期的Cyclin B1在G_1期异时相表达的作用机制及意义.方法 用丝裂原刺激因子(PHA)刺激人外周血淋巴细胞使之进入细胞周期,分别在刺激后0、36、48、60 h收集细胞,并分成两部分,一部分用流式Cyclins/DNA多参数技术分析,一部分用Post-sorting Western blot分析.结果 处于G_0期的淋巴细胞经PHA刺激进入细胞周期后,可以观察到Cyclin B1在G_1期有异时相表达,相应的CDK1亦有异时相表达.结论 异时相Cyclin B1/CDK1可能有助于正常在体细胞进入细胞分裂周期.