稳定表达突变减毒志贺样毒素Ⅰ的CHO细胞株的建立与鉴定

目的:建立稳定表达突变减毒志贺样毒素Ⅰ(Stx1)的CHO细胞株。方法:用脂质体介导将突变减毒Stx1真核表达载体pcDNA3.1-Stx1D10、pcDNA3.1-Stx1D100转染中国仓鼠卵巢细胞系CHO,G418筛选抗性克隆,PCR、RT-PCR、Western blot等方法检测阳性细胞株,有限稀释法获得稳定表达突变减毒Stx1的CHO细胞株。检测阳性细胞株的培养上清对人卵巢癌细胞SKOV3的生长抑制作用,并使用Stx 1 B亚基抗体对该作用进行阻断。结果:经2次克隆化获得稳定表达突变减毒Stx1的基因工程细胞株,Western blot检测和SKOV3细胞生长抑制实验证实该细胞株可以分泌突变减毒Stx1,该毒素对SKOV3细胞具有生长抑制作用且该作用可以被Stx1 B亚基抗体阻断。结论:成功地建立了分泌性表达突变减毒Stx1的CHO细胞株,命名为CHO/Stx1D10和CHO/Stx1D100。证实Stx1的天然信号肽可以被真核细胞识别从而使其被真核细胞分泌性表达。     

可溶性sCD80-Linker-sCD40L融合蛋白诱导非特异性抗肿瘤免疫

目的:观察可溶性sCD80-Linker-sCD40L融合蛋白对体外非特异性抗肿瘤免疫的影响。方法:以含sCD80-Lin- ker-sCD40L、sCD80、sCD40L编码基因的重组腺病毒载体或对照病毒载体转染人卵巢癌细胞SKOV3,ELISA检测上清中可溶性sCD80-Linker-sCD40L融合蛋白及sCD80、sCD40L蛋白的表达。由卵巢癌患者外周血单个核细胞培养树突状细胞(dendritic cells,DCs),将DCs和自体T细胞共同培养并加入不同上清诱导48h;用异基因混合淋巴细胞反应(mixed lymphocyte reaction,MLR)检测诱导的DCs刺激淋巴细胞增殖能力;以诱导的T细胞为效应细胞,SKOV3细胞或K562细胞为非特异性靶细胞,通过乳酸脱氢酶(lactate dehydrogemse,LDH)释放实验检测杀伤活性。结果:ELISA检测证实病毒转染SKOV3细胞上清中sCD80-Linker-sCD40L融合蛋白、sCD80蛋白和sCD40L蛋白表达量分别为2.791 ng/ml、1.956 ng/ml和1.407 ng/ml。MLR证实,与对照相比,融合蛋白上清诱导的DCs[刺激-反应细胞比例1:100,(0.382±0.053)vs(0.167±0.028),P<0.01;刺激-反应细胞比例1:50,(0.636±0.164)vs(0.311±0.067),P<0.01;刺激-反应细胞比例1:10,(1.245±0.271)vs(0.423±0.156),P<0.01]和sCD40L上清诱导的DCs[刺激-反应细胞比例1:100,(0.341±0.062)vs(0.167±0.028),P<0.01;刺激-反应细胞比例1:50,(0.567±0.106)vs(0.311±0.067),P<0.01;刺激-反应细胞比例1:10,(1.098±0.263)vs(0.423±0.156),P<0.01]刺激同种异基因混合淋巴细胞增殖能力明显增强。LDH释放实验提示,sCD40L上清诱导的T淋巴细胞对靶细胞非特异性杀伤活性显著强于对照SKOV3组[(42.28±6.27)vs(22.49±3.56),P<0.01]和K562组(47.94±6.72)vs (26.33±2.89),P<0.01],而融合蛋白上清诱导的T淋巴细胞对靶细胞非特异性杀伤活性显著强于sCD40L上清诱导的T淋巴细胞[sKOV3组为(58.97±8.92)vs(42.28±6.27),P<0.05;K562组为(66.55±9.43)vs(47.94±6.72),P<0.05]。结论:可溶性sCD80-Linker-sCD40L融合蛋白能有效诱导体外非特异性抗肿瘤免疫,对肿瘤免疫治疗具有潜在应用价值。     

CD40L在CD4^＋CIK诱导Fas抵抗乳腺癌细胞凋亡中的机制研究

目的:探讨CD40/CD40L交联在诱导Fas抵抗乳腺癌细胞凋亡中的免疫学机制.方法:体外大规模扩增自体CIKs细胞,利用磁珠分选系统纯化其中CD4+T细胞亚群(CD4+OK).用抗Fas激活性抗体CHll诱导乳腺癌细胞系MDA-MB-231细胞凋亡,比较有无CD4+CIK培养上清预处理对MDA-MB-231细胞凋亡率的影响.MDA-MB-231细胞与CD4+CIK在不同效靶比下共孵育6小时和24小时,分别用流式细胞仪检测凋亡率和膜Fas表达,定量RT-PCR法检测胞浆内Bax、Bcl-2、FADD 和c-FLIP)的mRNA含量.在共培养系统中加入抗FasL、抗CD40L和抗IFN-γ中和抗体,分别比较MDA-MB-231细胞凋亡率、膜Fas表达和四种凋亡相关基因的mRNA含量.结果:MDA.MB-231细胞对CHIl诱导的凋亡有抵抗,但经过CD4+CIK培养上清预处理后,敏感性显著提高.MDA-MB-231细胞与CD4+CIK共孵育24小时后,细胞凋亡率明显升高,并与膜Fas表达量呈正相关(r=0.618,P<0.01).在共培养体系中添加抗FasL和抗CD40L中和抗体可完全清除增加的细胞凋亡,而抗IFN-γ中和抗体只能部分清除,凋亡率分别从(33.70±2.77)%降至(7.57±1.15)%、(7.80±0.26)%和(14.21±1.70)%.但MDA-MB-231细胞膜Fas表达可以等效地被抗CD40L和抗IFN-γ中和抗体封闭,分别从(25.90±2.45)%降至(6.93±1.56)%和(8.73±4.70)%.定量RT-PCR结果显示MDA.MB-231细胞与CD4+CIK共孵育6小时时胞浆中c-FLIP表达下降与凋亡率显著相关(r=0.898,P<0.05),而抗CD40L中和抗体可诱导c-FLIP表达升高.结论:CD40/CD40L交联和IFN-γ刺激均参与了CIM+CIK诱导的MDA-MB-231细胞凋亡,但其Fas抵抗性的逆转主要是通过CD40/CIMOL交联抑制c-FLIP的mRNA合成而实现的.     

人环指蛋白11与核因子κB调控蛋白肿瘤坏死因子α诱导蛋白3相互作用蛋白1相互作用的研究

目的泛素化是机体重要的蛋白质的修饰方式,人环指蛋白(ring finger protein,RNF)11是泛素连接酶家族成员之一,可能在肿瘤形成过程中发挥重要的作用。肿瘤坏死因子α诱导蛋白3相互作用蛋白1(tumor necrosis factorα-induced pro-tein 3-interacting protein 1,TNIP1)是重要的核因子κB(nuclear factor kB,NF-κB)调控蛋白,可通过多种途径调控NF-κB的表达及细胞凋亡。文中研究RNF11下游功能及其与TNIP1之间的相互作用,明确RNF11的亚细胞定位。方法用PCR等方法构建人NFκB调控蛋白TNIP1全长及缺失不同位点的突变体,并观测其在293T细胞中的表达。用免疫共沉淀(co-immunoprecipita-tion,co-IP)方法鉴定其与人RNF11的相互作用,并确定其结合位点,用共聚焦显微镜观测其亚细胞定位。结果成功构建了人TNIP1的全长及其缺失不同位点的突变体并使其在293T细胞中表达。证实RNF11与TNIP1存在相互作用并确定其相互结合位点位于TNIP1的第311至535位氨基酸,。确定RNF11的亚细胞定位于细胞质。结论人RNF11可与TNIP1在细胞内相互结合,其主要的结合位点位于311至535位氨基酸。RNF11主要定位于细胞质,可能参与细胞内蛋白的降解过程。     

突变减毒志贺样毒素Ⅰ真核表达载体的抗肿瘤血管活性

目的：考察突变减毒志贺样毒素Ⅰ（Shiga-like toxin 1,Stx1）真核表达载体抗肿瘤血管的活性。方法：使用流式细胞仪检测突变减毒Stx1真核表达载体转染对CHO细胞的影响;分别建立稳定表达1/10毒性、1/100毒性的突变减毒Stx1的CHO细胞株,使用这2个细胞株和对照细胞株的培养上清分别处理人脐静脉内皮细胞（human umbilical vein endothelial cell,HUVEC）,观察其对HUVEC的增殖、迁移能力和形成管样结构能力的影响;使用人卵巢癌SKOV3荷瘤裸鼠模型,不同毒性突变减毒Stx1真核表达载体经脂质体包裹后肿瘤局部注射给药,观察突变减毒Stx1对肿瘤新生血管的作用。结果：突变减毒Stx1真核表达载体转染的CHO细胞未出现明显的凋亡或坏死改变;获得稳定表达1/10毒性、1/100毒性的突变减毒Stx1的基因工程细胞株,这些细胞株的培养上清与正常CHO细胞培养上清相比,能够在体外实验中抑制HUVEC的生长（P〈0.05）,且该作用可以被Stx1B亚基抗体阻断;突变减毒Stx1能够抑制HUVEC的迁移能力和管样结构形成能力;体内实验显示1/10毒性、1/100毒性的突变减毒Stx1真核表达载体治疗组与空载体对照组或生理盐水对照组相比,肿瘤微血管密度明显下降（P〈0.01）。结论：成功建立了分泌性表达突变减毒Stx1的CHO细胞株。证实突变减毒Stx1能够有效地抑制HUVEC的生长及正常功能的发挥。体内实验显示突变减毒Stx1真核表达载体可以抑制裸鼠体内SKOV3移植瘤的血管生成。     

sCD80-Linker-sCD40L融合基因重组腺病毒载体的构建及其在NIH3T3细胞的表达

目的:构建人sCD80-Linker-sCD40L融合基因重组腺病毒载体,观测其在真核细胞中的表达。方法:以RT-PCR法从人外周血单个核细胞总RNA扩增IL12B亚基信号肽、sCD80和sCD40L编码序列,以重叠PCR法获得带有IL12B亚基信号肽的sCD80-Linker-sCD40L融合基因。使用AdMax腺病毒包装系统构建携带融合基因的重组腺病毒载体。以重组病毒感染NIH3T3细胞,观察融合基因的表达。结果:经测序证实,正确构建了携带sCD80-Linker-sCD40L融合基因的重组腺病毒载体。RT-PCR和Western blot证实融合基因在NIH3T3细胞中表达。结论:成功构建了携带sCD80-Linker-sCD40L融合基因的重组腺病毒载体,并在真核细胞中表达,为后续研究奠定了基础。     

抗ABL胞内抗体对K562细胞酪氨酸激酶活性的影响

目的:观察人慢性粒细胞白血病(CML)细胞转导抗ABL胞内抗体基因后,对其酪氨酸激酶活性的影响。方法:构建逆转录病毒载体MSCV-ib-IRES-eGFP,转导K562细胞,分选eGFP 的细胞,用RT-PCR检测胞内抗体mRNA的表达,观察细胞内BCR/ABL、c-ABL酪氨酸激酶活性及细胞总蛋白酪氨酸激酶活性的变化。结果:获得表达胞内抗体的K562细胞:K562-ib-eGFP。RT-PCR证实胞内抗体mRNA在K562-ib-eGFP细胞内表达。与对照组相比,K562-ib-eGFP细胞内BCR/ABL和c-ABL蛋白酪氨酸激酶活性及总蛋白酪氨酸激酶活性明显受抑制。结论:转导抗ABL胞内抗体能有效降低CML细胞内ABL酪氨酸激酶活性,为进一步研究打下基础。     

流式细胞术检测调节性T细胞方法的建立

目的建立流式细胞术（FCM）检测外周血CD4＋CD25＋调节性T细胞（Tregs）的方法，并观察紫杉醇联合卡铂治疗对晚期肺癌和乳腺癌患者外周血CD4＋CD25＋Tregs数量的影响。 方法19例晚期肺癌和10例乳腺癌患者均给予紫杉醇联合卡铂方案化疗，于化疗前1d和化疗后第7天采集患者外周血，分别加入鼠抗人CD4-FITC（异硫氰酸荧光素）/CD8-PE（藻红蛋白）/CD3-PerCP（多甲藻叶绿素蛋白）、CD25-FITC/CD127-PE/CD4-PerCP、CD3-FITC/CD（16＋56）-PE/CD45-PerCP单抗，并以分别加入同型鼠抗人IgG1-FITC、IgG1-PE、IgG1-PerCP抗体作为阴性对照。采用流式细胞术（FCM）检测化疗前后外周血CD3＋、CD4＋、CD8＋T细胞和CD4＋CD25＋Tregs、NK细胞所占比例并进行数据分析。实验重复3次。 结果与化疗前比较，晚期肺癌和乳腺癌患者化疗后外周血CD4＋CD25＋Tregs的比例均明显降低（6.82%±3.11%vs.5.48%±2.13%，P=0.045；6.38%±1.84%vs.3.88%±1.69%，P=0.007）；晚期肺癌患者化疗后外周血CD4＋T细胞的比例升高（48.84%±16.44%vs.56.35%±14.50%，P=0.006），CD8＋T细胞的比例降低（51.18%±16.44%vs.43.65%±14.50%，P=0.006），CD4＋/CD8＋T细胞比值升高（1.12±0.60vs.1.57±0.88，P=0.008），而CD3＋T细胞和NK细胞的比例均无明显变化；乳腺癌患者化疗后外周血CD3＋、CD4＋、CD8＋T细胞、NK细胞的比例和CD4＋/CD8＋T细胞比值均无明显变化。 结论成功建立了FCM检测CD4＋CD25＋Tregs的方法，联合应用CD4、CD25、CD127检测CD4＋CD25＋Tregs简便可行、重复性好，检测结果可靠、准确，比较适用于临床检验。紫杉醇联合卡铂能够降低晚期肺癌和乳腺癌患者外周血CD4＋CD25＋Tregs的数量。     

人环指蛋白11真核表达载体的构建及表达

目的构建含有标签蛋白的人环指蛋白11(ring finger protein 11,RNF11)的真核表达载体,并观测其在293T细胞中的表达。方法使用MEGA5.0等生物学软件构建人RNF11的分子进化树;应用RT-PCR从4种人胃癌细胞系中检测到该基因的表达,并将其克隆到pEASY-Blunt载体中,酶切测序鉴定正确后,再将其连接到真核表达载体pCMV-HA中,酶切鉴定正确后转染293T细胞,Western-blotting测其表达。结果重组的携带有RNF11的真核表达载体酶切鉴定后显示载体及片段的大小正确,将该真核表达载体转染293T细胞后使用Western-blotting检测到了融合蛋白的表达。结论携带有标签蛋白的人RNF11基因的真核表达载体pCMV-HA-RNF11克隆及表达成功,为进一步研究其与其它蛋白质的相互作用奠定了基础。     

抗ABL酪氨酸激酶区胞内抗体抑制K562细胞体外生长

目的:观察人慢性粒细胞白血病细胞转导抗ABL酪氨酸激酶区胞内抗体基因后,对其体外生长的影响。方法:通过表达抗ABL蛋白酪氨酸激酶区胞内抗体的模型:K562-ibE-eGFP细胞,观察该细胞与对照细胞在有血清培养条件下的细胞生长和无血清培养条件下细胞活力,并观察无血清培养24h细胞形态学变化。结果:与对照组相比,K562-ibE-eGFP细胞在有血清培养条件下生长受抑制,在无血清培养条件下细胞活力显著下降,并且无血清培养24h细胞出现早期凋亡形态变化。结论:通过转导抗ABL酪氨酸激酶区胞内抗体的方法能抑制慢性粒细胞白血病细胞体外生长,并促进其在无血清条件诱导下凋亡,这可能是细胞内酪氨酸激酶活性降低,BCR/ABL信号途径被阻断,逆转了BCR/ABL对细胞生长和凋亡的影响作用。