靶向小鼠Abcb11基因CRISPR/Cas9系统的构建及效率检测

目的：ABCB11基因突变是肝内胆汁淤积症2型(PFIC-2)的主要病因，本研究试图构建特异性靶向小鼠Abcb11基因的CRISPR/Cas9系统，并检测该系统的基因编辑效率。方法：根据小鼠Abcb11基因的DNA序列，设计3条sgRNA导向序列，通过构建sgRNA表达载体，将sgRNA质粒和Cas9质粒一起转入N2a细胞，药物筛选，阳性细胞DNA的PCR产物测序以及TA克隆测序等实验，完成基因编辑系统构建及效率检测。结果：sgRNA3导向序列可用于编辑小鼠Abcb11基因，编辑效率为61.54%。结论：靶向小鼠Abcb11基因的编辑系统构建成功，且有较高的编辑效率，为后续建立精准模拟人类PFIC-2疾病的小鼠模型以及临床治疗奠定了基础。     

构建模拟人致病位点突变的靶向小鼠Krt14的CRISPR/Cas9系统

目的 建立可模拟人类KRT14强致病位点突变的高效靶向小鼠Krt14的CRISPR/Cas9系统.方法 本研究通过检索多个数据库筛查人类单纯性大疱性表皮松懈症(EBS)致病的基因KRT14强致病突变位点,并通过人和小鼠KRT14蛋白序列比对分析将筛查到的强致病位点定位于小鼠基因组上.根据CRISPR/Cas9系统的基因...     

基于CRISPR/Cas9系统高效编辑小鼠miR let-7a

目的 构建靶向小鼠miR let-7a的高效CRISPR/Cas9系统。方法 根据小鼠miR let-7a的两个编码位点let-7a-1和let-7a-2的编码序列各设计了两对dual-sgRNAs导向序列，通过sgRNA表达载体的构建、小鼠N2a细胞的共转染、药物筛选、阳性细胞PCR产物测序以及TA克隆测序分析等实验步骤完成了4对dual-sgRNAs导向序列的打靶效力分析。结果 所构建的4对打靶载体在细胞中发挥了作用，打靶位点均出现了碱基插入或缺失，药物筛选阳性细胞打靶位点RCR产物Sanger法测序峰图在4个靶点位置均有套峰出现。TA克隆测序结果表明本研究设计的4对dual-sgRNAs导向序列的打靶效率分别为42.10%、62.50%、52.63%和47.37%。结论 本研究所设计的4对dual-sgRNAs导向序列均可以有效介导Cas9蛋白切割小鼠miR let-7a,形成突变效应。为后续miR let-7a作用靶点的深入挖掘，阐明其发挥抑癌功能的作用机制提供了依据。     

男性不育患者Y染色体AZF区域STS微缺失位点多重PCR法检测及其意义

目的：探讨Y染色体无精子症因子（AZF）区域的15个标签位点（STS）序列片段微缺失位点与男性不育（MI）的关系,为干预遗传性MI提供依据。方法：选择2 586例疑似MI患者作为研究对象,按照年龄分为≤20岁组（14例）、21～30岁组（988例）、 31～40岁组（1 318例）和≥41岁组（266例）。采用聚合酶链式反应（PCR）法对Y染色体AZF区域的15个STS序列片段进行检测并筛选异常结果,比较各组MI患者Y染色体微缺失情况。结果：在2 586例参检人群样本中发现207例Y染色体异常,占总体样本的8.00%;其中≤20岁组、21～30岁组、31～40岁组和≥41岁组检出Y染色体异常率分别为7.14%(1/14)、8.10%(80/988)、8.04%(106/1 318)和7.52%(20/266);各组患者基础位点合并扩展位点的缺失率比较差异有统计学意义（χ2=10.836,P=0.013）,21～30岁组患者基础位点合并扩展位点的缺失率明显高于31～40岁组（P<0.05）;在总体受检样本中,发生基础位点片段缺失者52例,异常率为2.01%,各组患者异常率比较差异有...