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目的 观察携带增强绿色荧光蛋白（GFP）的含人干细胞白血病（SCL）基因慢病毒载体转染体外培养的豚鼠膀胱Cajal样间质细胞（ICC）的效果。方法 2014年10月-2015年8月,选取普通级成年健康豚鼠16只。构建含人SCL基因的慢病毒载体,并标定病毒滴度;采用随机数字表法选取健康豚鼠4只,采用颈椎脱臼方法将其杀死,体外培养豚鼠膀胱ICC。设置不同感染复数（MOI）（0.5、1.0、5.0、10.0、50.0、100.0）,利用含人SCL基因的慢病毒载体转染ICC,在激光共聚焦显微镜下观察ICC生长状态并计算转染效率,确定最佳MOI。采用随机数字表法将ICC分为正常对照组、空白质粒对照组与慢病毒转染组,其中正常对照组加入1%磷酸盐缓冲液（PBS）,空白质粒对照组加入空慢病毒,慢病毒转染组按最佳MOI加入含人SCL基因的慢病毒载体,计算各组转染效率,确定最佳转染时间。采用反转录-聚合酶链式反应（RT-PCR）法检测SCL mRNA表达情况。上述实验均独立重复4次。结果 经测定,病毒滴度为5×108 TU/ml。倒置显微镜下发现一些特征性梭形细胞,其两侧有显著外凸分枝,细胞核较大,其外形规则,有序地实现细胞贴壁,而其他未贴壁细胞则呈现与ICC不一样的形态,胞体多为椭圆形,细胞两极无突起,整体形状扁平。激光共聚焦显微镜下可以发现酪氨酸蛋白激酶生长因子受体（c-kit）受体成功表达,证实培养的细胞是膀胱ICC。观察各组ICC生长状态,当MOI为0.5、1.0、5.0、10.0时,细胞生长状态较好,无细胞死亡,当MOI为50.0、100.0时,可见部分细胞死亡,细胞活性降低;MOI为1.0、5.0、10.0、50.0、100.0时的转染效率高于MOI为0.5时（P＜0.05）;MOI为5.0、10.0、50.0、100.0时的转染效率高于MOI为1.0时（P＜0.05）;MOI为10.0、50.0、100.0时的转染效率高于MOI为5.0时（P＜0.05）;MOI为50.0、100.0时的转染效率高于MOI为10.0时（P＜0.05）;综合ICC生长状态及转染效率,确定含人SCL基因慢病毒载体转染ICC的最佳MOI为10.0。正常对照组、空白质粒对照组ICC中无GFP表达;慢病毒转染组转染3 d时ICC中GFP表达强度高于转染2 d、转染5 d时,确定含人SCL基因慢病毒载体转染ICC的最佳转染时间为3 d。慢病毒转染组中扩增产物大小与目的片段大小1 036 bp一致,而正常对照组及空白质粒对照组均未见特异性条带表达,表明SCL基因成功导入ICC。结论 利用含人SCL基因慢病毒载体能高效转染体外培养的ICC,并成功介导SCL基因在ICC中的表达,为下一步研究利用SCL基因进行体内转染实验奠定基础。 相似文献
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正训练伤种类及发生原因疲劳性训练伤。训练是基层部队的常规工作,且训练时间长、任务多。部分刚刚入伍的新兵因不能很快很好适应部队的训练任务,就会导致身体时常处于超负荷状态。在此状态下,肌肉的韧带和身体的骨骼在高负荷的训练过程中,处于高度疲劳状态,加之长时的超负荷训练,造成身体容易发生较大的损伤。卫生学训练伤。基层部队训练强度大、时间久、任务重,体能消耗较大,目前的营养供给制度,虽然能够保证官兵平时所必需的各种营养,但是由于不同任务的官兵进行的训练项目有所不 相似文献
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摘要：目的 构建含人干细胞白血病（SCL）基因的重组慢病毒载体,并转染体外培养的Cajal样间质细胞（ICC）,为进一步利用慢病毒表达载体行体内实验奠定基础。方法 通过聚合酶链反应（PCR）将人SCL基质粒内的遗传物质扩增,与慢病毒载体质粒GV287-EGFP结合,构建重组质粒GV287-EGFP/SCL,通过Western blot检测及基因测序对阳性克隆进行鉴定,并测定病毒滴度。体外分离、培养及鉴定ICC,重组慢病毒载体以感染复数（MOI）值为0.5、1.0、5.0、10.0、50.0和100.0时,分别转染ICC,通过激光共聚焦显微镜观察,计算不同MOI值的转染效果,确定最佳MOI值。重组慢病毒载体以最佳MOI值感染ICC作为实验组,以空载体转染的ICC（空载体组）及未转染的ICC（空白组）作为对照,通过逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）检测SCL基因在ICC中的表达。结果 经Western blot检测及基因测序鉴定SCL重组慢病毒表达载体构建成功,并成功转染ICC,激光共聚焦显微镜下可观察到强绿色荧光。MOI为10时转染效果最佳,转染效率>85%;RT-PCR结果表明,实验组SCL基因的表达量高于空载体组和空白组。结论 成功制备人SCL基因重组慢病毒载体,并能高效转染ICC,介导SCL基因在ICC中表达。
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