Hedgehog信号通路抑制剂对肝内胆管癌RBE细胞生物学行为的影响

 目的: 研究Hedgehog(Hh)信号通路特异性抑制剂环杷明(cyclopamine)对人肝内胆管癌细胞株RBE生物学行为的影响。方法: 用台盼蓝染色计数法和MTT比色法检测环杷明对RBE细胞增殖的影响;流式细胞术检测凋亡率,Transwell检测环杷明处理前后RBE细胞侵袭能力的变化,Western blot检测环杷明处理前后RBE细胞中Gli1和MMP-9的蛋白表达变化。结果: 环杷明对RBE细胞株增殖的抑制作用呈剂量和时间依赖性。环杷明作用细胞24 h、48 h、72 h后,RBE细胞凋亡率逐渐升高,明显高于对照组的凋亡率。Transwell检测对照组穿透细胞数为154.52±13.61,而实验组穿透数为62.00±12.17,侵袭能力明显下降(P<0.01)。Gli1和MMP-9蛋白均在RBE细胞中表达,环杷明下调RBE细胞的Gli1和MMP-9表达。结论: 阻断Hh信号通路能抑制RBE细胞的增殖,促进其凋亡,并抑制其侵袭能力。     

小鼠胚胎心流出道的形态发生与呼吸内胚层发育耦联

目的 探讨小鼠胚胎心发育过程中前肠呼吸内胚层与第一生心区和第二生心区及胚胎心流出道的形态发生关系。方法 胚龄7.5～13d小鼠胚胎心各3个,连续石蜡切片,用抗胰岛素增强子结合蛋白1（ISL-1）、抗心肌肌球蛋白重链（MHC）、抗α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）、抗Nkx2.5和抗增殖细胞核抗原（PCNA）抗体进行免疫组织化学或免疫荧光染色。结果 胚胎发育7.5d,ISL-1在生心板心肌前体细胞表达并与发育中的第二生心区ISL-1阳性细胞连续。胚胎发育第10～13天, 可见ISL-1强阳性的前肠腹侧呼吸内胚层细胞增生,排列不规则,     

连接蛋白43在小鼠胚胎心的时空表达规律

目的:探讨连接蛋白43 (Cx43)在小鼠胚胎心的时空表达规律及意义.方法:用抗Cx43、抗心肌肌球蛋白重链(MHC)和抗横纹肌肌节肌动蛋白(α-SCA)对胚龄9～17 d小鼠胚胎心连续切片进行免疫组织化学或免疫荧光显色;免疫印迹检测胚龄11、13、15、16d和17d小鼠胚胎心组织中Cx43的含量变化.结果:胚龄9～10 d,仅在左心室腹侧壁及原始小梁最先检测到Cx43弱阳性表达.随着发育,Cx43在心房心室阳性范围逐渐扩展,阳性表达逐渐增强.而在某些特定部位,如窦房结、房室管、房室结和房室束等始终未见Cx43阳性染色.结论:Cx43在胚胎心的时空表达模式与心工作心肌和传导系心肌的发育及兴奋传导功能相适应.     

WT1异构体比例转变对人白血病细胞株HL-60增殖和凋亡的影响

 目的： 探讨WT1异构体比例改变对人白血病细胞株HL-60增殖和凋亡的影响。方法： 逆转录获得人WT1(17AA－/KTS－)异构体全长cDNA序列,连接到PCDH1-MCS1-EF1-copGFP慢病毒质粒载体上, 酶切和测序证实正确构建重组质粒,建立WT1异构体表达比例改变的单克隆细胞株。MTT法检测细胞增殖活性,形态学观察及Annexin V 检测细胞凋亡。结果： 成功构建了真核表达载体PCDH1-MCS1-EF1-copGFP-WT1(17AA－/KTS－),转染HL-60细胞后,实时荧光定量RT-PCR和Western blotting 显示重组质粒转染细胞中WT1(17AA－/KTS－) mRNA和蛋白水平明显高于空质粒转染组和正常对照组。重组质粒转染细胞的生长抑制率高于空质粒转染组和正常对照组, 差异显著(P<0.05)。加2 μmol/L 三氧化二砷（As2O3）培养48 h后, 形态学观察发现3组细胞都出现了凋亡形态, 但重组质粒转染细胞更为明显。流式细胞术结果显示,As2O3作用24 h后,重组质粒转染细胞凋亡率较空质粒转染组和正常对照组细胞升高,差异显著(P<0.05)。结论： 增加外源性WT1(17AA－/KTS－)异构体的表达能抑制HL-60细胞增殖,促进As2O3 诱导的细胞凋亡。     

小鼠胚胎呼吸内胚层形态发生与咽前间充质发育及流出道分隔的关系

目的 探讨呼吸内胚层与咽前间充质细胞发育的关系及对小鼠胚胎心流出道分隔的影响。方法 45只胚龄8~13d小鼠胚胎心连续石蜡切片,用抗胰岛因子1（ISL-1）、抗α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）、抗音猬因子（音速波状蛋白, Shh）、抗patched（Ptc1）、抗patched 2（Ptc2）、抗smoothened（Smo）及抗心肌肌球蛋白重链（MHC）抗体进行免疫组织化学及免疫荧光染色。 结果 胚龄8～9d,ISL-1阳性细胞分布在心包腔背侧壁及前肠两侧间充质,并延伸至原始心管动脉端,心管心肌显较强的Ptc1和Ptc2阳性表达。胚龄10~13d,呼吸内胚层向腹侧延伸,Ptc1和Ptc2呈较强表达,ISL-1阳性咽前间充质细胞围绕呼吸内胚层形成对称的特征性锥体形结构,经动脉囊背侧壁伸入动脉囊腔,形成主肺动脉隔。胚龄12d,主肺动脉隔ISL-1阳性表达基本消失,大部分细胞转变为α-SMA阳性细胞。 结论 呼吸内胚层的分化发育与咽前ISL-1阳性间充质细胞的发育聚集密切耦联。发育中的呼吸内胚层可能作为组织中心,通过Shh信号通路对ISL-1阳性细胞的聚集提供位置信息。呼吸内胚层的正常腹侧延伸不但可诱导ISL 1阳性细胞的正常迁移和流出道的正常分隔,对流出道的正常形态发生及有效的肺循环建立起重要作用。     

显示组胺阳性细胞免疫组化技术的方法

目的选择光镜下显示组胺阳性细胞免疫组织化学技术所适用的固定液及组胺抗体的最佳稀释度。方法在4种常用固定液中用免疫组化SP法选择效果最佳的固定液,将组胺浓缩型抗体稀释十个等级梯度,从中选取最佳抗体稀释度。结果4%多聚甲醛液固定效果最好,组胺抗体以1∶400稀释度最佳。结论确定了显示组胺阳性细胞免疫组化技术最佳的固定液和组胺抗体稀释度,为进一步研究组胺细胞的形态和功能提供实验技术方面的资料。     

自噬下降参与了β1肾上腺素受体自身抗体诱导的H9c2心肌细胞凋亡

目的 探讨自噬下降对β₁肾上腺素受体自身抗体(β₁adrenergic receptor autoantibodies, β₁-AA)诱导的H9c2心肌细胞凋亡的作用。方法 使用1 μM的β₁-AA对H9c2心肌细胞进行处理,Real time-PCR检测自噬相关基因LC3 mRNA表达的改变,Western blot检测LC3、Beclin 1以及P62蛋白表达水平的变化;使用流式细胞术、Caspase-3活性检测以及Hoechst 33258染色反映细胞凋亡情况;使用经典的自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤(3-Methyladenine, 3-MA)预处理30 min以及mTOR通路抑制剂雷帕霉素(rapamyein,RAPA)预处理1 h后,再给予细胞β₁-AA处理,检测此时细胞凋亡的变化情况。结果 1 μM的β₁-AA干预H9c2心肌细胞6 h可以明显降低细胞存活率;β₁-AA干预细胞6 h、12 h、24 h,LC3 mRNA水平依次降低,LC3II和Beclin 1蛋白水平依次降低,P62蛋白水平逐渐增加,表明β₁-AA可以引起心肌细胞自噬水平逐渐下降;同时发现,β₁-AA干预细胞6 h、12 h,细胞凋亡水平明显升高;使用经典自噬抑制剂3-MA预处理心肌细胞30 min抑制自噬后,H9c2心肌细胞凋亡水平较β₁-AA单独处理组显著增加,相反使用经典mTOR通路抑制剂RAPA预处理心肌细胞1 h上调自噬后,心肌细胞凋亡水平较β₁-AA单独处理组明显下降,说明自噬水平改变可以影响心肌细胞凋亡水平。 结论 自噬下调能够增加β₁-AA诱导的H9c2心肌细胞凋亡。     

超极化激活环核苷酸门控阳离子通道4、连接蛋白43和平足蛋白在小鼠胚胎心的表达与心传导系的发生

目的 探讨小鼠胚胎心传导系的发生机制。方法 用抗心肌肌球蛋白重链（MHC）、抗超极化激活环核苷酸门控阳离子通道4（HCN4）、抗缝隙连接蛋白43（CX43）和抗平足蛋白（podoplanin）抗体,对40只胚龄9~16d小鼠胚胎心进行连续石蜡切片并免疫组织化学或免疫荧光染色。结果 胚龄9d,较强的HCN4阳性表达集中在MHC阴性的静脉窦壁,随心脏发育,HCN4较强阳性表达逐渐向窦房结转移。胚龄11d开始,CX43阴性表达显示部位特异性。CX43阴性染色经窦房结沿右心房背侧壁和左、右静脉瓣向房室管背侧壁延伸。胚龄13d,左、右静脉瓣与房间隔底部融合后,进一步延续为房室管背侧壁发育中的CX43阴性染色的房室结,继而与室间隔顶部CX43阴性的房室束相连。胚龄9~10d,在MHC阳性心肌、心包腔背侧壁脏壁中胚层心肌前体细胞及静脉窦周间充质均显示podoplanin阳性表达。胚龄11~13d,podoplanin阳性间充质细胞沿心脏外表面扩展形成podoplanin阳性间皮样心外膜。结论 心脏发育早期,主起搏点位于静脉窦壁,起搏电位的产生早于收缩功能的发生。CX43阴性心肌是发育中的心传导系心肌,在胚龄11d即可观察到心传导系早期雏形。podoplanin参与促进心肌前体细胞向心肌细胞的分化。