基于差异蛋白质组学技术解析xCT缺陷诱导的细胞死亡机制

目的：对Sut黑色素细胞和野生型黑色素细胞进行高分辨率差异蛋白质组学分析,探讨xCT缺陷引起细胞生长抑制的机制。方法分离Sut黑色素细胞和野生型黑色素细胞总蛋白,进行双向电泳和串联质谱分析,获得数值经Mascot软件处理后通过NCBI及Swiss-Prot蛋白质数据库检索,结合双向凝胶电泳相应点的表观等电点、相对分子质量、匹配肽段的多少和序列覆盖率等综合分析筛选差异蛋白质;逆转录-PCR分析Sut细胞差异蛋白mRNA表达水平,用蛋白免疫印迹法对xCT缺陷的Sut黑色素细胞进行自体吞噬分析。结果与结论得到20个明显上调或下调的蛋白,经MALDI-TOF质谱分析鉴定差异蛋白质,发现与自体吞噬和囊泡运输相关的调控因子（ Anxa3、Hist 1h2bk、NDRG1、CaM）以及与细胞转移相关的调控因子（S100A-4、S100A-6、波形蛋白）表达发生了改变;对自噬标志蛋白分析发现,在xCT缺陷的Sut细胞中发生了自体吞噬。结果表明,xCT缺陷可能通过与细胞外基质的黏附异常以及激活Sut黑色素细胞中自噬相关的信号通路,从而导致细胞的生长抑制和自噬性死亡。     

xCT调节乳腺癌细胞转移的作用机制研究

目的：探讨xCT调节人类乳腺癌细胞株MDA－MB－231转移的作用及其机制。方法采用细胞划痕实验和Transwell实验分析xCT受到抑制和敲低后,人类高转移乳腺癌细胞株MDA－MB－231迁移及侵袭能力的改变。用Western印迹法和RT－PCR检测其自噬相关标志物LC3,上皮细胞间充质化（ EMT）过程相关标志物钙黏蛋白E （E－cadherin）、波形蛋白（vimentin）以及Snail表达水平的改变。结果抑制和敲低MDA－MB－231细胞株中xCT的表达后,钙黏蛋白E表达升高,波形蛋白表达降低,转录因子Snail的蛋白水平降低,但其 mRNA水平无明显变化,自噬相关蛋白LC3－Ⅱ／LC3－Ⅰ的比值升高。结论抑制和敲低xCT的表达可使MDA－MB－231细胞株发生自噬,降解转录因子Snail,从而抑制EMT,降低MDA－MB－231细胞株的转移能力。     

丝氨酸代谢在脐带血红系细胞增殖过程中的作用研究

目的 通过探索氨基酸代谢对红系细胞体外扩增的影响,为提高脐带血红系细胞体外扩增的效率以制备大量的红系细胞奠定基础.方法 高效液相色谱法(HPLC)测定脐血单个核细胞(MNC)中造血细胞向红系细胞分化及增殖过程中培养基内氨基酸的消耗情况,筛选出消耗多的氨基酸;进一步选择人脐带血来源的红系祖细胞系(HUDEP-2)作为研究对象,对其培养体系进行特定氨基酸的缺乏与补加,通过细胞计数、EdU掺入实验结合流式细胞术等方法分析特定氨基酸在红系细胞扩增过程中的作用;向红系培养体系中添加特定氨基酸代谢的抑制剂,进一步评价该氨基酸代谢在红系细胞扩增过程中的作用.结果 HPLC法检测发现,红系细胞定向分化及增殖过程中丝氨酸的消耗最为显著.在缺乏丝氨酸的培养体系中,红系祖细胞系HUDEP-2的增殖与存活受到明显抑制,但丝氨酸的缺乏并不影响HUDEP-2细胞表面红系细胞特征蛋白的表达.向红系培养基中添加丝氨酸分解代谢的关键酶抑制剂——丝氨酸羟甲基转移酶(SHMT)抑制剂SHIN1后,发现SHIN1明显抑制HUDEP-2的增殖与存活.结论 丝氨酸是维持红系细胞增殖能力的关键氨基酸,其分解代谢产生的一碳单位可能是红系细胞增殖所必需的,该结果为体外进一步提高脐带血红系细胞的扩增效率提供了实验依据.     

xCT影响肝癌细胞转移的作用机制研究

目的：探讨人类肝细胞癌中xCT（氨基酸转运系统system xc-的功能性亚基）的表达对于自噬、EMT（上皮细胞间质化）和肿瘤细胞转移的影响.方法：用Western Blot和RT-PCR方法检测肿瘤细胞在xCT抑制剂SASP（柳氮磺胺毗啶）的作用下,其自噬和EMT过程相关基因的表达水平的改变.伤口愈合实验和Transwell分析xCT在受到抑制后,肿瘤细胞迁移能力的改变.结果：SASP处理过的97H人类高转移肝癌细胞与对照组相比,自噬相关蛋白LC3和Beclin1表达升高,EMT的标志物E-cadherin表达升高,Vimentin的表达降低,参与EMT过程的重要转录因子Snail表达降低.结论：抑制xCT的表达可以使人类高转移肝癌细胞发生自噬,降低转录因子Snail的表达,从而减弱EMT过程的发生并降低人类高转移肝癌细胞的转移能力.     

波形蛋白在细胞凋亡中的变化

波形蛋白(vimentin)是一种中间纤维蛋白，由单一多肽链构成，主要分布在中胚层来源的组织中。在细胞中，波形蛋白主要作为结构蛋白起作用。在细胞凋亡过程中，波形蛋白很快被水解。其主要的裂解位点分别位于Asp85和Asp259位置；波形蛋白的裂解是由半胱氨酰天冬氨酸蛋白酶(caspase)或被该酶激活的一组蛋白酶介导的；由caspase介导的波形蛋白在Asp85位的裂解导致产生一个N端小片段，此片段能够诱导依赖于caspase的细胞凋亡。     

基于MATLAB的隐马尔可夫模型预测蛋白质结构类

目的 准确预测蛋白质结构类,为研究其空间结构及生物功能打下基础.方法 应用隐马尔可夫模型(HMM)预测蛋白质结构类,分别构建3-状态HMM和8-状态HMM.数据来源于Chou和Zhou构建的蛋白质数据集,分别包含有204条蛋白质序列和498条蛋白质序列,通过留一法预测其准确率.结果 所构建的3-状态HMM和8-状态HMM对全α类的预测准确率最高,尤其是3-状态HMM的预测准确率达到95％以上.与Chou数据集相比,Zhou数据集对于全β类和α/β类的预测准确率也有所提高,同时,总体预测率也提高了2％左右;但α+β类的预测准确率有所下降.结论 将整条蛋白质序列作为预测模型的输入信息所构建的HMM模型能有效地预测蛋白质的结构类.     

TNF-α诱导B16细胞自体吞噬的作用研究

目的 研究肿瘤坏死因子a(TNF-a)诱导小鼠黑色素瘤B16细胞自体吞噬和自噬性死亡的作用.方法体外培养小鼠黑色素瘤B16细胞,TN F-a(20ng/ml)处理后不同时间点(12、24h)分别收取细胞,相差显微镜观察TNF-α处理前后B16细胞的生存状态,透射电子显微镜(TEM)观察TNF-a处理前后B16细胞内双层膜结构自体吞噬泡的情况,反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)、蛋白免疫印迹分析自噬标记物微管相关蛋白1轻链3(LC3]和Beclin1以及自噬相关基因(Atg)Atg5、Atg7、Atg12表达的变化,以LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ的比值作为自噬活性的指标,以Beclin1作为自噬性死亡的指标.结果TNF-a处理B16细胞24 h后自体吞噬泡数量增多.与对照组相比,TNF-α持续作用可以诱导自噬标记物LC3-Ⅱ和自噬性死亡标记物Beclin1蛋白表达增高,并且呈时间依赖性;同时自噬相关基因Atg5、Atg7 、Atg12 mRNA的表达在TNF-a处理12、24h后显著增高.结论TNF-α除了可以诱导B16细胞凋亡,还可诱导B16细胞发生自体吞噬并导致自噬性死亡.     

老年性痴呆大鼠血清的蛋白质组学研究

目的以老年性痴呆（AD）大鼠为研究对象,应用蛋白质组学方法在血清中筛选与AD密切相关的蛋白质,为研究AD的发病机制提供理论支持。方法通过Morris水迷宫记忆行为学筛选符合痴呆标准的AD大鼠模型,收集AD组大鼠及假手术组大鼠的血清后,去除血清中的高丰度蛋白质并进行蛋白质浓度的测定,之后进行双向凝胶电泳,挑选差异最为明显的蛋白质点进行肽质量指纹图谱分析,经数据库查询,鉴定差异蛋白质。结果经观察二维凝胶电泳图谱后,发现AD组大鼠与假手术组大鼠的血清中共有10个差异明显的蛋白质点,选取了2个最为明显的蛋白质点进行鉴定,分别为：血浆视黄醇结合蛋白前体,补体成分4,基因2（C4b）。结论C4b是新发现的与AD相关的蛋白质,有可能是潜在的AD标志物,有助于更深刻地理解AD的发病机制。