人突变p27基因对大肠癌细胞SW480生长的影响

目的：观察人突变p27基因（p27mt）对人大肠癌细胞生长的影响，探讨p27mt基因在大肠癌基因治疗中的作用机制。方法：以携带突变p27基因复制缺陷型腺病毒（Ad—p27mt）为载体，转染大肠癌细胞SW480；用Western blot方法检测p27mt蛋白的表达；细胞计数法检测p27mt对SW480细胞生长的抑制作用；用流式细胞仪检测细胞周期：用DNA片段分析法检测细胞凋亡。结果：通过免疫印迹分析Ad—p27mt转染SW480细胞后，p27在细胞中出现了蛋白高表达。PI染色流式细胞仪检测77．96％的细胞阻滞于G0/G1期，而Ad—LacZ组及空白对照组分别为27．57％和25．29％；生长曲线显示Ad—p27mt对细胞生长就有明显的抑制作用；DNA片段分析示p27mt基因可诱导细胞的凋亡。结论：p27mt对细胞周期有明显的阻滞作用，主要阻滞于G0／G1期；p27mt基因对细胞的生长抑制机制与诱导细胞凋亡和细胞周期的阻滞有关。     

痹康灵对骨关节炎治疗作用的实验研究

为观察痹康灵对骨关节炎(OA)的治疗效果并探讨其作用机制,将32只中国白兔分为正常对照组(A组)、空白对照组(B组)、西药对照组(C组)、中药治疗组(D组),每组各8只,A组不造模,B、C、D组均采用Hulth法建立兔OA模型.术后3天给予A和B组生理盐水,C组罗非昔布溶液,D组痹康灵,每天各6ml*kg-1,灌胃给药.自术后第1周每天驱赶动物2次,共30分钟,4周后取右侧胫骨平台关节软骨和滑膜进行光镜观察.采用免疫组化检测法分别检测关节软骨和滑膜中的白细胞介素-1β(IL-β)、基质金属蛋白酶-1(MMP-1)、基质金属蛋白酶-3(MMP-3)的水平.结果显示,B组IL-1β,MMP-1、MMP-3的水平均非常显著高于A组(P＜0.01),并均显著高于C组(0.01＜P＜0.05);B组IL-1β、MMP-3水平显著高于D组(0.01＜P＜0.05),而MMP-1水平则非常显著高于D组(P＜0.01);C组与D组间上述3指标水平无显著性差异(P＞0.05).光镜观察,B组退变较其余3组明显;C组与D组间退变不明显;但2组退变均甚于A组.表明痹康灵能抑制IL-1β、MMP-1、MMP-3的产生,具有抗炎、保护和修复关节软骨的作用,从而对OA有一定的治疗作用.     

细胞穿透肽YARA介导增强型绿色荧光蛋白转导入人结直肠癌细胞的实验研究

目的 构建原核表达载体pET15b-YARA EGFP,表达并纯化出融合蛋白YARA-EGFP,观察其穿透人结直肠癌细胞的情况.方法 用分子克隆技术构建出表达型载体pET15b-YARA-EGFP,在E.coli BL21(DE3)中表达融合蛋白YARA-EGFP,将鉴定和纯化后的融合蛋白加入体外培养的人结直肠癌细胞.结果 得到纯化的融合蛋白YARA-EGFP,能高效地转导入体外培养的人结直肠癌细胞,并表现出剂量和时间依赖性,MTT法检测在其高浓度时仍对细胞无毒性.结论 YARA-EGFP融合蛋白能高效地转导入体外培养的人结直肠癌细胞.     

间充质干细胞成血管因子受体表达特征及其意义

目的:探讨间充质干细胞成血管因子受体表达特征及其意义。方法:采用经典的全骨髓贴壁法培养骨髓源间充质干细胞(MSC),通过成骨、成脂肪等多向诱导分化以及流式细胞分析其表面标记(CD34、CD90、CD29)等鉴定MSC特征;以P1-P17MSC为实验材料,利用RT-PCR的方法检测PDGFR、VEGFR和NRP1的表达。利用Transwell体外迁移体系初步探索VEGF在MSC迁移中的作用,同时利用MTT法评价VEGF对MSC增值的作用。结果:培养的MSC呈现出CD90、CD105强阳性,具有成骨、成脂肪等多向分化能力;强表达PDGFR-β和NRP1、不表达VEGFR(Flk1和Flt1)和PDGFR-α,VEGF促进了MSC的增殖和迁移。结论:VEGF可能通过PDGFR-NRP1促进了MSC的增值和迁移。     

PEP-1-SOD1融合蛋白转导入大鼠心肌组织的能力及其酶活性

目的:研究PEP-1-SOD1融合蛋白转导进人大鼠心肌组织的能力,并测定转导的目的蛋白酶活性.方法:实验分为SOD1组和PEP-1-SOD1组,分别经大鼠尾静脉注射500 μg纯化后的SOD1及500μg纯化后的PEP-1-SOD1融合蛋白入大鼠体内,于注射后0.5,1,2,4,8,24 h时间点取心脏(n=6,每组,每个时间点),经40 g/L多聚甲醛溶液固定6 h后行冰冻切片,通过免疫组织化学方法检测PEP-1-SOD1进入大鼠心肌组织的能力和分布情况.黄嘌呤氧化酶法测定心肌组织SOD1活性.结果:PEP-1-SOD1组注射后0.5 h时,大鼠心肌组织中即出现均一的明亮红色荧光信号,分布于细胞浆及细胞核,具有时间依赖性的特点,荧光强度最强点为1 h时间点,而SOD1组未见到红色荧光信号.于注射后0.5 h时SOD1活性开始升高PEP-1-SOD1组为(85.37±1.67),SOD1组为(52.23±0.67),两组相比较,差异具有统计学意义(P<0.01);注射后1 h时SODl活性可达高峰,PEP-1-SOD1组为(119.16±1.37),SOD1组为(53.47±1.02),两组相比较,差异具有统计学意义(P<0.01),2～24 h逐步下降;SOD1组各时间点间相比较差异无统计学意义(P>0.05).结论:PEP-1-SOD1融合蛋白能以天然活性形式迅速高效的转导人大鼠心肌组织,并保持酶活性达24 h.     

PEP-1-SOD1对离体缺血再灌注损伤大鼠心肌Bax、Bcl-2蛋白表达的影响

目的:研究细胞穿透肽PEP-1介导人铜锌-超氧化物歧化酶(Cu,Zn-SOD,SOD1)对大鼠离体心肌缺血再灌注损伤(MIRI)细胞凋亡的影响。方法:采用Langendorff灌流系统对离体大鼠心脏进行停灌-复灌建立心肌缺血再灌注损伤模型。大鼠随机分为对照组、SOD1蛋白预处理组,25、50、100μmol/L PEP-1-SOD1蛋白预处理组。复灌结束后,TUNEL法检测心肌细胞凋亡,免疫荧光法检测心肌组织Bax、Bcl-2蛋白表达。结果:与对照组及SOD1组相比,各PEP-1-SOD1组心肌细胞凋亡指数(AI)显著下降,Bcl-2蛋白表达升高,Bax蛋白表达显著减少(P<0.01)。结论:PEP-1-SOD1融合蛋白可抑制离体心脏缺血再灌注损伤大鼠心肌细胞凋亡,其机制可能与上调Bax表达及下调Bcl-2表达有关。     

Fas Ligand基因转染对大鼠血管平滑肌细胞凋亡的影响

目的 :研究腺病毒介导FasLigand基因转染对大鼠血管平滑肌细胞凋亡的影响。 方法 :常规分子生物学技术构建重组腺病毒Ad FasL、Ad βgal。免疫组化方法检测转染Ad FasL的大鼠血管平滑肌细胞FasLigand蛋白表达。用TUNEL法检测转染腺病毒的血管平滑肌细胞是否发生凋亡。结果 :10 0moiAd FasL转染大鼠血管平滑肌细胞 ,10 0 %细胞表达FasLigand蛋白 ,并发生凋亡。结论 :大鼠对Ad FasL转染诱导的凋亡易感。因此可以推断Ad FasL转染损伤后血管壁将减少血管平滑肌细胞积累。Ad FasL转染可能是有效的再狭窄治疗策略     

凋亡素VP3蛋白的原核表达及纯化

目的构建凋亡素VP3蛋白的原核表达质粒,并进行诱导表达和蛋白纯化。方法采用PCR法自PGEX-6P-1/TAT-VP3质粒中扩增VP3基因,运用靶向克隆酶将VP3基因插入线性pET15b,构建重组表达质粒pET-15b-VP3;经测序证实构建成功后转化E.coli Rosetta,表达凋亡素VP3蛋白;经Ni-NTA树脂亲和层析,对纯化产物进行SDS-PAGE、Western blotting分析鉴定。结果成功构建凋亡素VP3蛋白原核表达质粒,表达并纯化了分子量为13.6 kD的凋亡素VP3蛋白。结论凋亡素VP蛋白原核表达载体的构建及目的蛋白的表达纯化,为体内应用凋亡素VP3蛋白进行抗肿瘤研究奠定了基础。     

靶向克隆法构建PEP-1-VP3基因的原核表达载体

目的 利用PCR 产物靶向克隆法构建细胞穿透肽-凋亡素(PEP-1-VP3)的原核表达载体.方法 以PGEX-6P-1/TAT-VP3 质粒为模板,PCR 扩增VP3 基因的366 bp 片段,应用靶向克隆酶,将VP3 基因插入到线性pET15b-PEP-1,得到重组表达质粒pET15b-PEP-1-VP3,经过筛选,挑选出阳性克隆进行Nde Ⅰ和BamHⅠ双酶切图谱分析和重组质粒核苷酸序列分析以鉴定所构建的原核表达载体.结果 PCR产物经过电泳可见366 bp 特征性的VP3 片段,重组的质粒经过双酶切获得了一个大小为440 bp 的特征性PEP-1-VP3 片段,重组质粒测序证实VP3 cDNA 编码区成功地克隆入了pET15b-PEP-1,且其序列与GeneBank 中VP3 cDNA 序列完全一致.结论 靶向克隆法可快速、高效地构建PEP-1-VP3 基因的原核表达载体,为制备PEP-1-VP3 融合蛋白奠定基础.     

调经活血汤对多囊卵巢大鼠卵巢颗粒细胞凋亡的影响及机制研究

目的 研究调经活血汤对多囊卵巢(PCO)大鼠的血清激素水平、卵巢质量、形态及卵巢颗粒细胞凋亡等的影响,探讨其治疗效果及作用机制.方法 大鼠造模成功后随机分成中药治疗组和对照组,观察动物体重增加幅度、血清激素水平变化情况,末端脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP缺口末端标记法(TUNEL)观察卵巢颗粒细胞凋亡,免疫组化法观察颗粒细胞凋亡调控蛋白Bcl-2、Bax表达水平的变化.结果 治疗组动物体重增加幅度明显降低,中药治疗组血清T浓度较对照组、正常组显著性降低;血清E2较对照组明显降低;血清P水平较对照组明显升高,血清FSH、LH浓度与对照组无明显差异.中药治疗组卵巢镜下可见多个囊状扩张的卵泡,但体腔较对照组明显缩小,颗粒细胞层数增加至4～7层,并可见少量黄体形成;中药治疗组卵巢颗粒细胞凋亡率较对照组显著降低,卵巢颗粒细胞Bcl-2表达的OD值较对照组显著增高,Bax表达的OD值显著降低.结论 调经活血汤能使多囊卵巢大鼠卵巢颗粒细胞凋亡相关蛋白bcl-2表达明显升高,Bax表达明显降低,巢颗粒细胞凋亡率显著性降低;卵巢颗粒细胞层数增加,黄体形成增加:体重、血清T、E2激素水平明显下降,血清P激素水平明显升高,其作用可能与调节卵巢颗粒细胞上Bcl-2和Bax蛋白表达,影响两蛋白的比例关系,增加Bcl-2/Bax的比值,使Bax与Bcl-2蛋白形成异源二聚体,发挥其抗细胞凋亡的作用有关.