天花粉对糖尿病大鼠降糖作用的研究

目的:探讨中药天花粉对糖尿病大鼠降糖作用的影响。方法:40只大鼠随机抽取8只作为正常对照组,其余大鼠用四氧嘧啶建立实验性糖尿病大鼠模型,造模大鼠筛选后,随机分为二甲双胍对照组、模型对照组、天花粉大剂量组(2.25g/kg)、天花粉小剂量组(1.12g/kg),8只/组,用天花粉原液治疗两周,测定体重、尿量及空腹血糖。结果:模型对照组空腹血糖升高至(21.09±1.62)mmol/L,与正常对照组比较差异均有统计学意义(P<0.05),天花粉大小剂量组空腹血糖水平下降明显,与模型组比较差异有统计学差异(P<0.05)。结论:天花粉对四氧嘧啶性糖尿病大鼠具有降血糖作用。     

食管癌细胞ezrin基因启动子TPA反应性的研究

背景与目的:研究食管癌细胞eznn基因启动子的TPA反应性以及TPA诱导ezrin基因转录的MAPK信号转导途径. 材料与方法:应用转录因子数据库分析预测ezrin基因-87/+134序列的潜在转录因子结合位点和TPA反应元件;采用双荧光素酶报告基因分析系统,检测ezrin基因-87/+134序列的启动子活性和TPA反应性,TPA反应元件结合蛋白Spl和AP-1对ezrin基因的转录激活作用,以及MAPK抑制剂对TPA诱导激活的ezrin基因转录的抑制作用.结果:ezrin基因-87/+134序列存在潜在TPA反应元件,具有启动子活性;5 ng/ml 11PA显著增强ezrin/n基因启动子活性[P<0.01);Sp1和AP-1对ezrin基因具有转录激活作用;MEK1/2特异性抑制剂U0126和PD98059降低TPA诱导的ezrin基因转录激活作用. 结论:食管癌细胞中,ezrin基因启动子具有TPA反应性;TPA可能通过MEK/ERK1/2磷酸化Sp1/AP-1途径调控ezrin基因转录.     

转录因子Sp1和Sp3对食管癌细胞ezrin基因的表达调控作用

目的:明确转录因子Sp1和Sp3对食管癌细胞ezrin基因的表达调控作用.方法:将转录因子表达载体CMV-Sp1和CMV-Sp3分别转染食管癌EC109细胞,采用定量RT-PCR和Western blot技术检测过表达转录因子Sp1和Sp3对ezrin mRNA和蛋白表达的影响;将ezrin基因启动子驱动的报告基因表达载体与内参照质粒pRL-TK和转录因子表达载体共转染EC109细胞,采用双荧光素酶报告基因分析系统检测转录因子Sp1和Sp3对ezrin基因启动子的激活作用以及这种激活作用是否依赖于ezrin基因的Sp1结合位点-75/-69.结果:过表达转录因子Sp1和Sp3显著提高EC109细胞ezrin mRNA和蛋白表达水平以及启动子活性.Sp1和Sp3增强ezrin基因启动子活性的作用位点不同,只有Sp1通过-75/-69位点调控ezrin基因启动子活性.结论:转录因子Sp1和Sp3可调控EC109细胞ezrin基因的表达.     

ezrin基因在几种癌细胞中的表达及其5′侧翼区序列转录活性的鉴定

 目的检测ezrin基因在几种癌细胞中的表达及其5′侧翼区序列的转录活力,探讨ezrin基因在癌细胞的表达调控机制。方法采用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)及Western blot法检测ezrin基因在食管癌细胞EC109、EC171、EC8712、SHEEC,胃癌细胞N87、BGC823,肺癌细胞A549、95D,肝癌细胞HepG2,白血病细胞K562和宫颈癌细胞HeLa中的mRNA和蛋白表达水平;采用PCR法构建以ezrin基因翻译起始位点上游-1444/+134序列为启动子的真核细胞表达质粒pGLB-hE(-1444/+134);采用双荧光素酶报告基因分析系统检测-1444/+134序列在EC109、Hela、A549和BGC823细胞中的转录活力。结果ezrin基因在食管癌等几种癌细胞中均有高表达,其5′侧翼区-1444/+134序列具有较强的转录活力。结论ezrin基因5′侧翼区序列的转录活性可能对ezrin基因的几种癌细胞中的高表达起重要作用。     

HeLa细胞中ezrin基因主要转录调控区的定位分析

目的：鉴定ezrin基因在HeLa细胞中的主要转录调控区,初步研究ezrin基因的转录调控机制。方法：采用嵌套缺失技术构建一系列以ezrin基因翻译起始位点上游不同长度DNA序列作为报告基因启动子的重组pGLB质粒,利用双荧光素酶报告基因分析系统检测启动子的转录活力,并利用在线分析程序预测ezrin基因主要转录调控区的潜在转录因子结合位点。结果：获得一系列含不同长度ezrin基因5′侧翼区序列的重组pGLB质粒;当ezrin基因5′侧翼区序列从-1324截短到-890时,转录活力降低约80%,从-146截短到-32时,转录活力几乎完全丧失;在-1324/-890和-146/-32区,存在大量的Sp1转录因子结合位点。结论：在HeLa细胞中,ezrin基因的-1324/-890和-146/-32区是主要的转录调控区。Sp1可能是调控基因转录的重要转录因子。     

Notch1 胞内段荧光表达质粒的构建及鉴定

目的：构建能够在鼻咽癌细胞株中高效表达人Notchl信号胞内段（NIC）的荧光质粒。方法：通过RT—PCR获得人NIC的cDNA;利用基因重组技术插入到pEGFP—N1中;在脂质体介导下转染人低分化鼻咽癌细胞CNE2后,经荧光显微镜、RT—PCR和Westernblot检测NIC的表达情况。结果：RT—PCR方法得到一条2424bp的特异性扩增产物,酶切和基因测序结果表明重组质粒构建成功。转染48h后,检测到绿色荧光表达,RT～PCR和Westernblot的结果显示NIC的表达量升高。结论：正确构建了人NIC荧光表达质粒。该质粒能够在鼻咽癌细胞株中高效表达,为研究Notch信号通路在鼻咽癌中的作用奠定了实验基础。     

食管癌细胞Ezrin基因转录调控区克隆及其启动子活性的鉴定

目的:克隆食管癌侵袭转移相关基因Ezrin的转录调控区序列,进行启动子活性鉴定及初步的生物信息学分析。方法:利用在线程序对Ezrin基因可能的转录调控区进行GC含量和CpG岛分析以及转录因子结合位点预测;采用PCR法从食管癌细胞基因组DNA中克隆Ezrin基因-1759/ 134和-726/ 134区段,构建萤火虫荧光素酶报告基因表达质粒pGLB-hE(-1759/ 134)和pGLB-hE(-726/ 134),检测所克隆片段的启动子活性。结果:Ezrin基因5′侧翼区为高GC含量区,存在CpG岛,无典型的TATA盒,然而转录因子Sp1结合位点却无处不在。与对照质粒pGLB相比,重组质粒pGLB-hE(-726/ 134)具有较强的荧光素酶活性,pGLB-hE(-1759/ 134)的荧光素酶活性约是pGLB-hE(-726/ 134)的2倍。结论:Ezrin基因的-726/ 134区段具有启动子活性,含有Ezrin基因的核心启动子区和调节性启动子区;-1759/-726区段具有增强启动子活性的作用,含有Ezrin基因增强子元件区。     

HeLa细胞ezrin基因基本启动子区转录调控元件的鉴定

 目的 鉴定HeLa细胞中调控ezrin基因基本启动子活性的顺式作用元件,探讨ezrin基因在HeLa细胞的表达调控机制。 方法 采用碱基定点突变实验和双荧光素酶报告基因分析系统,检测在HeLa细胞中Sp1结合位点(-75/-69, 相对于转录起始位点)和AP 1结合位点(-64/-58)对人ezrin基因基本启动子活性的影响;采用电泳迁移率变动分析法(EMSA)实验,检测ezrin基因基本启动子区序列与HeLa细胞核蛋白提取物的特异性结合活性。 结果 在HeLa细胞中,单独删除和置换Sp1结合位点或AP 1结合位点,ezrin基因基本启动子活性降低50％左右;同时置换Sp1结合位点和AP 1结合位点,启动子活性几乎完全丧失。ezrin基因基本启动子序列能够与HeLa细胞核蛋白提取物相结合。 结论 HeLa细胞中,Sp1结合位点和AP 1结合位点为ezrin基因基本启动子区的重要转录调控元件,有可能存在某种转录因子与之结合,激活ezrin基因转录。     

Ezrin增强子敲除可抑制人食管癌Eca-109细胞的增殖和迁移

[摘要] 目的：探讨ezrin 增强子敲除对食管癌Eca-109 细胞ezrin 基因表达、细胞增殖和迁移的影响。方法：将靶向ezrin 增强子上、下游的CRISPR/Cas9 重组质粒共转染食管癌Eca-109 细胞,经嘌呤霉素筛选,获得敲除ezrin 增强子的细胞株Eca-C2。用qPCR和Western blotting 分别检测敲除ezrin 增强子的Eca-C2 细胞中ezrin mRNA和蛋白的表达,用蛋白芯片技术检测MAPK通路相关蛋白的表达,用WST-1 法和细胞划痕愈合实验分别检测ezrin 增强子敲除对Eca-C2 细胞增殖和迁移能力的影响。结果：成功构建稳定敲除ezrin 增强子的食管癌细胞株Eca-C2;与对照细胞相比,ezrin 增强子敲除细胞ezrin mRNA和蛋白的表达水平均明显降低（均P＜0.05）。Eca-C2 细胞中17 种被检测的MAPK通路相关蛋白中有9 种（AKT、CREB、GSK3b、MKK6、mTOR、P38、P53、P70S6K和RSK1）表达下调,ezrin 增强子敲除后细胞的增殖和迁移能力受到明显抑制（均P＜0.05）。结论：在人食管癌Eca-109 细胞中,敲除ezrin增强子可明显抑制细胞的增殖和迁移。     

食管癌细胞中fascin基因启动子区的克隆与初步鉴定

目的:对食管癌细胞中fascin基因启动子区进行克隆鉴定. 方法:应用PCR技术从食管癌细胞系EC109中扩增出fascin基因5′侧翼区5段不同长度的片段,并将其克隆至萤火虫荧光素酶报告基因表达载体pGL3-Basic(pGLB)中, 然后将这些质粒与对照质粒pGLB、内参照质粒pRL-TK共转染EC109细胞,48 h后用双荧光素酶检测系统分析这些重组子报告基因转染细胞的相对荧光强度,并结合生物信息学分析,以判断fascin基因启动子区所在位置. 结果:用DNA重组技术成功构建了5个系列缺失重组荧光素酶报告基因表达载体. 相对荧光素酶活性检测表明,与对照组相比,上述一系列重组质粒转染细胞均显示出较高的荧光素酶活性. 生物信息学分析发现,在启动子区(-436～ 1)有标志性调控元件TATA盒(-34～-29). 结论:在食管癌细胞中fascin基因的启动子区可能位于转录起始位点上游约436 bp的区段内.