携带ROCK2基因siRNA有效片段的慢病毒载体的筛选

目的:筛选能够显著抑制自发性高血压大鼠(SHR)阴茎海绵体平滑肌细胞内ROCK2基因表达的携带ROCK2基因siRNA的慢病毒载体。方法:设计并合成4个靶向ROCK2的siRNA片段,构建并包装成慢病毒载体。随机将5只SHR阴茎海绵体平滑肌细胞分为6组,每组每个样本3×104个细胞,每组5个样本,分别为:A组(未转染对照组)、B组(携带慢病毒转染组)、C~F组(分别携带靶向ROCK2基因siRNA 1~4号靶点的慢病毒转染组),以感染复(MOI)=80转染SHR阴茎海绵体平滑肌细胞,转染后48 h荧光显微镜下观察细胞GFP表达情况,并用RT-PCR检测各组被转染细胞ROCK2 mRNA的表达。结果:荧光显微镜下观察各组细胞转染效率均50%。与A组相比,B组ROCK2 mRNA的表达无明显改变(P﹥0.05);C、D、F组SHR阴茎海绵体平滑肌细胞ROCK2基因mRNA的表达较A组极显著下降(P0.01),抑制效率分别达到(43.91±8.19)%、(47.15±6.64)%、(25.7±6.03)%;E组SHR阴茎海绵体平滑肌细胞ROCK2基因mRNA的表达较A组显著下降(P0.05),抑制效率为(16.81±5.94)%。结论:本研究构建的4种携带ROCK2基因的siRNA慢病毒载体均能够显著抑制SHR阴茎海绵体平滑肌细胞内ROCK2基因的表达,其中有1种慢病毒载体抑制作用最强。     

自发性高血压大鼠阴茎海绵体平滑肌细胞培养及鉴定

目的:探讨自发性高血压大鼠(SHR)阴茎海绵体平滑肌(CCSM)细胞体外培养的方法、生物学性状及与WKY大鼠CCSM细胞培养的区别.方法:采用组织块培养法并应用差速贴壁法进行纯化,倒置相差显微镜观察其形态,免疫荧光与流式细胞仪法进行鉴定.结果:镜下可见平滑肌细胞呈梭形生长、平行排列及部分区域峰-谷现象,免疫荧光显示胞浆α-肌动蛋白染色呈阳性.WKY大鼠CCSM细胞第4d开始从组织块边缘游离出,SHR大鼠CCSM细胞第8d开始游离出.WKY与SHR大鼠CCSM细胞经纯化一次后纯度(％):WKY=97.00±1.03,SHR=84.90±5.99,差异具有统计学意义(P＜0.01);WKY与SHR大鼠CCSM细胞经两次纯化后纯度(％):WKY=98.24±1.05,SHR=96.92±1.06,其差异无统计学意义(P＞0.05).结论:SHR与WKY大鼠CCSM细胞的原代培养在生长时间及纯化上存在显著差异,但可通过适当方式缩小其差异并在短期内获得大量高纯度SHR大鼠CCSM细胞,为高血压性勃起功能障碍的研究奠定基础.