EGFP和CM-Dil示踪骨髓间充质干细胞构建组织工程骨的体内研究

目的:应用增强型绿色荧光蛋白(Enhanced green fluorescent protein,EGFP)和CM-Dil标记技术,观察组织工程骨在体内形成过程中种子细胞的变化和转归.方法:分别用EGFP慢病毒表达和CM-Dil染料的方法标记比格犬骨髓间充质干细胞(Bone mesenchymal stem cells,BMSCs),MTT法检测标记细胞的体外增殖能力.BMSCs接种珊瑚支架体外成骨诱导7天后,将未标记组、EGFP组和CM-Dil组分别植入裸鼠背部皮下,空白支架作为阴性对照.术后4、8、12周取材,HE染色观察成骨情况,EGFP组采用GFP免疫组化、CM-Dil组冰冻切片荧光显微镜下示踪BMSCs在体内的变化.结果:两种标记技术能高效标记BMSCs,标记前后细胞的体外增殖无显著性差异(P>0.05).细胞-支架复合物植入体内12周后有新生骨形成,标记细胞数量随时间延长而逐渐减少,12周后仍显示有部分标记细胞存活.结论:EGFP和CM-Dil可用于示踪组织工程种子细胞,通过示踪说明BMSCs在体内组织工程骨成骨过程中发挥了重要作用.     

荧光活性染料(CM-Dil)对人骨髓间充质干细胞增殖能力的影响

目的:体外分离、培养人骨髓间充质干细胞(human bone marrow derived mesenchymal stem cells,hBMSCs),探讨应用不同浓度氯甲基苯甲酰氨荧光染料(CM-Dil)对hBMSCs增殖力的影响。方法:采用Ficoll梯密度离心法分离、培养hBMSCs,并促进其分别向成骨细胞、脂肪细胞分化;应用不同浓度CM-Dil分别标记第3代hBMSCs,观察不同浓度标记下细胞的荧光强度、标记效率、活性和增殖能力。结果:采用Ficoll梯密度离心法获得的hBMSCs,成骨、成脂分化染色阳性。不同浓度CM-Dil(5、10、20、30μmol/L)在30 min内均可成功标记hBMSCs,24 h后观察标记效率均达到98%以上(P>0.05)。直到20μmol/L的标记浓度对细胞的活力、增殖能力仍没有影响(P>0.05)。结论:CM-Dil是一种简便、安全的标记骨髓间充质干细胞的方法。     

人骨髓间充质干细胞与脐静脉内皮细胞体外共培养的研究

目的观察人骨髓间充质干细胞（Human bone marrow mesenchymal stromal cells,hBMSCs）与脐静脉内皮细胞（Human umbilical vein endothelial cells,hUVECs）体外共培养对hBMSCs成骨作用及hUVECs成血管功能的影响。方法分离鉴定hBMSCs和hUVECs,将hBMSCs及hUVECs按1∶1比例直接共培养,倒置相差显微镜观察细胞的生长特性和细胞相容性,Matrigel实验观察共培养对hUVECs体外血管形成能力的影响。将hBMSCs成骨诱导7 d后,茜素红染色观察共培养对其成骨分化能力的影响。结果 hBMSCs与hUVECs体外共培养细胞相容性良好,Matrigel实验显示共培养组形成的毛细血管状结构较单一细胞组多。成骨诱导的hBMSCs中,共培养组茜素红染色阳性,单一细胞组茜素红染色阴性。结论 hBMSCs与hUVECs具有良好的细胞相容性,在共培养体系中,未诱导的hBMSCs能促进形成毛细血管状结构,已成骨诱导的hBMSCs成骨矿化能力增强。