转基因食品的快速PCR鉴定

用十六烷基-二甲基-乙基-溴化铵(CTAB)法快速高效地从样品中提取了可供分析的基因组DNA,经PCR扩增,鉴定了含有35S启动子和NOS终止子的转基因样品.该方法的灵敏度可达0.1%,并且具有很好的稳定性.     

耐热过氧化氢酶基因工程菌的构建及其发酵条件

利用PCR扩增技术以嗜热脂肪芽孢杆菌IAM11001染色体DNA为模板,扩增得到嗜热脂肪芽孢杆菌过氧化氢酶编码基因perA。再与经EcoRⅠ酶切的温控表达载体pBV220连接,构建重组质粒,并转化宿主大肠杆菌JM109,得到耐热过氧化氢酶基因工程菌,然后对该工程菌在LB培养基和半合成培养基中的发酵条件进行了优化。结果表明：在LB培养基中,诱导时期和酶合成最佳诱导时间均为5h,最大产酶量达到72．9U／mL;在半合成培养基中,于30℃培养4h,再于42℃诱导培养6h,产酶量最高达到131U／mL。     

优化简并引物PCR克隆Candida glycerinogenes 3-磷酸甘油脱氢酶基因片段

为了从工业生产菌株耐高渗产甘油假丝酵母(Candida glycerinogenes)克隆甘油合成的限速酶编码基因胞浆NAD -3-磷酸甘油脱氢酶基因(ctGPD),对不同酵母和其他真核生物的NAD -3-磷酸甘油脱氢酶进行比对,分析氨基酸和核苷酸的保守序列,设计了4对简并引物用于扩增C.glycerinogenes的NAD -3-磷酸甘油脱氢酶(GPD)基因片段,经过优化PCR反应条件,利用其中一对中等简并度的引物扩增出CgGPI)基因中约600 bp的保守核心片段.DNA序列及推绎的氨基酸序列进行比对分析表明,该基因片段与其他酵母的胞浆NAD -3-磷酸甘油脱氢酶基因的对应区域具有典型的保守区域,并且与安格斯毕赤酵母的GPI)基因相似性较高.     

产甘油假丝酵母两种转化方法的比较

为了研究产甘油假丝酵母高产甘油和耐高渗的机制,以Zeocin作为选择标记,考察和比较了两种转化方法,即醋酸锂法和电转化法的转化效果,以建立简单有效的产甘油假丝酵母转化体系。结果表明,细胞生长时期是影响转化率的关键因素。在OD600约为1.3时制备感受态细胞,在电压为1.5 kV时进行电击,可获得较高转化率,为每微克DNA 139个转化子。在OD600约为1.0时制备感受态细胞,醋酸锂预处理细胞1 h,获得的转化率为每微克DNA 154个转化子。综合考虑,醋酸锂法更适合于产甘油假丝酵母的转化。     

产甘油假丝酵母烯醇化酶基因的克隆及序列分析

从产甘油假丝酵母(Candida glycerinogenes)基因文库中分离了一个含烯醇化酶基因(CgENO1)的克隆子.插入片段全长2 456 bp,包含一段1 314 bp的没有内含子的蛋白质编码区,编码一个含438个氨基酸残基的多肽链,其氨基酸序列与来源于酿酒酵母的烯醇化酶相似性为74.3%.多重序列比对显示,产甘油假丝酵母烯醇化酶(CgENO1)含有酵母烯醇化酶全部保守区.对编码区上下游序列分析显示,克隆片段含有典型的酵母基因上下游调控区,是一个完整的酵母新基因.     

产甘油假丝酵母甘油合成关键酶基因CgGPD1多拷贝表达载体的构建及其在大肠杆菌中的表达

采用PCR的方法从产甘油假丝酵母(Candida glycerinogenes) 中扩增出3-磷酸甘油脱氢酶的编码基因及侧翼序列 CgGPD1,分别构建了含不同 CgGPD1 拷贝数的根癌农杆菌双元载体pCAM3300-zeocin-CgGPD1(Ⅰ)、pCAM3300-zeocin-CgGPD1-CgGPD1(Ⅱ)和pCAM3300-zeocin-CgGPD1 -CgGPD1-CgGPD1(Ⅲ).在大肠杆菌JM109中,研究了其在不同质量浓度NaCl、葡萄糖胁迫下表达情况.结果表明,在大肠杆菌中GPDH的活性随着NaCl、葡萄糖质量浓度的升高而增加.当NaCl质量浓度达到2.5 g/dL时,GPDH的酶活比在0.5 g/dL NaCl下平均提高31.2%; 当葡萄糖质量浓度提高至10 g/dL时,GPDH的酶活比2 g/dL葡萄糖下平均提高31.8%;在相同的NaCl、葡萄糖质量浓度下,GPDH的活性随着 CgGPD1 拷贝数的增加而升高,JM109(Ⅱ)比JM109(Ⅰ)的GPDH酶活平均提高8.2%,JM109(Ⅲ)比JM109(Ⅱ)的GPDH酶活平均提高9.9%.以上结果表明,在大肠杆菌中 CgGPD1 基因的表达同样受渗透压胁迫调节.     

编码1,3-丙二醇氧化还原酶同工酶基因yqhD的克隆与高效表达

利用PCR技术从大肠杆菌（既cherichia coli）中扩增出1．16kb的编码1，3-丙二醇氧化还原酶同工酶的基因yqhD，将其连接到温控表达载体pHsh，得到重组哉体pHsh-yqhD，重组载体在大肠杆菌JM109中得到高效表达。SDS-PAGE分析显示：融合表达产物的相对分子质量均为43000，同核酸序列测定所推导的值相符。对含有yghD的基因工程菌进行表达研究表明：42℃诱导4h，1，3-丙二醇氧化还原酶同工酶的酶活力达到100IU／mg，而对照菌株的酶活力仅为0．5IU／mg。     

根癌农杆菌介导酿酒酵母的遗传转化

根癌农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）可以将它的Ti质粒的一段T-DNA序列转化到广泛的宿主细胞并能整合到宿主染色体中.作者利用根癌农杆菌转化系统成功地实现了产甘油假丝酵母（Candida glycerinogenes）乳清苷酸脱羧酶基因（Ura3）对酿酒酵母（Saccharamyces cerevisiae）W303-1A的Ura3缺陷遗传互补转化,转化率约为3.2个转化子/10^5个酵母细胞.通过转化子PCR和表型验证说明了T-DNA已经整合进入酵母染色体,并能够稳定地进行遗传表达.     

荧光素酶编码基因luc在大肠杆菌中的克隆、表达及纯化

以荧光虫荧光素酶报告载体pXP2 DNA为模板,扩增得到编码萤火虫荧光素酶(LUC)的基因(luc),构建了诱导型表达载体pQE30-luc.将载体导入 E.coli M15获得高效诱导表达萤火虫荧光素酶基因的重组菌M15/pQE30-luc.SDS-PAGE电泳分析显示:重组蛋白的相对分子质量为 60 000 ,表达量占全菌胞内可溶性蛋白质的50.9 %. 利用表达载体pQE30上的His*Tag标记选用Ni柱纯化表达具有活性的萤火虫荧光素酶(LUC),纯化后比酶活达到1.43×10 9 RFU/ mg,纯化倍数达10.6倍,回收率为25.3%.     

影响根癌农杆菌的电击转化条件

采用电击转化方法将双元载体质粒pCAM3300导入根癌农杆菌LBA4404,研究了不同实验条件对转化率的影响.结果表明:当电场强度为11 kV/cm时,转化率最高,每微克DNA得到9.8×103CFU;在细胞OD600为1.0时进行电转化,转化率最高,每微克DNA得到9.54×103CFU;在一定的细胞浓度范围内,电击转化率与细菌浓度密切相关,转化率随着细菌浓度的上升而上升;质粒大小与电击转化率之间没有明确的关系.将含pCAMBIA3300的根癌农杆菌与粗糙脉胞菌共培养转化,在含有膦化麦黄桐(PPT)(405 mg/L)的平板上筛选到转化子.PCR扩增转化子的染色体,初步证明Bar基因整合进粗糙脉胞菌的染色体中.